Strategiile tradiționale de diagnosticare pentru detectarea bolilor infecțioase necesită utilizarea instrumentelor de banc care nu sunt potrivite pentru testarea la punctul de îngrijire (POCT).Microfluidica emergentă este o tehnologie extrem de miniaturizată, automatizată și integrată, care este o alternativă potențială la metodele tradiționale pentru diagnosticare la fața locului rapidă, cu cost redus și precis.Metodele de diagnostic molecular sunt utilizate pe scară largă în dispozitivele microfluidice ca fiind cele mai eficiente metode pentru detectarea agenților patogeni.Această revizuire rezumă progresele recente în diagnosticarea moleculară pe bază de microfluidice a bolilor infecțioase atât din perspectivă academică, cât și industrială.În primul rând, descriem o procesare tipică pe cip a acizilor nucleici, inclusiv pretratarea probei, amplificarea și citirea semnalului.Sunt apoi comparate caracteristicile, avantajele și dezavantajele celor patru tipuri de platforme microfluidice.În continuare, vom discuta despre utilizarea testelor digitale pentru cuantificarea absolută a acizilor nucleici.Atât dispozitivele de diagnostic moleculară clasice, cât și cele recente comerciale pe bază de microfluidice sunt rezumate ca dovezi ale stării actuale a pieței.În sfârșit, propunem direcții viitoare pentru diagnosticul microfluidic al bolilor infecțioase.
Bolile infecțioase sunt cauzate de agenți patogeni, inclusiv bacterii, viruși și paraziți, care sunt răspândiți în întreaga lume.Spre deosebire de alte boli, agenții patogeni se infectează rapid și se răspândesc între oameni și animalele gazdă prin inoculare, medii de aer și apă [1].Prevenirea bolilor infecțioase este esențială ca măsură de sănătate publică.Trei strategii principale de combatere a bolilor infecțioase: (1) controlul sursei de infecție;(2) întreruperea căii de transmisie;(3) protecția populațiilor susceptibile.Dintre principalele strategii, controlul sursei de infecție este considerată cea mai importantă strategie datorită confortului și costului redus.Diagnosticul rapid, izolarea și tratamentul persoanelor infectate sunt critice, necesitând strategii de diagnostic rapide, sensibile și precise [2].Diagnosticul actual al bolilor infecțioase combină de obicei examinarea clinică bazată pe semne și simptome și studii de laborator, cum ar fi cultura celulară și diagnosticul molecular, care necesită personal instruit, proceduri care necesită multă muncă și echipamente de testare costisitoare [3, 4].Prevenirea focarelor de boli infecțioase necesită un diagnostic local rapid, ieftin și precis, în special în zonele cu resurse limitate, unde bolile infecțioase sunt frecvente și severe [5], precum și tratament în sălbăticie sau pe câmpul de luptă, unde urgențele sunt imprevizibile..îngrijirea medicală este limitată [6].În acest context, microfluidica este o tehnologie care combină tehnologiile sistemelor microelectromecanice, nanotehnologia sau știința materialelor pentru manipularea precisă a fluidelor [7,8,9,10], oferind noi posibilități de detectare la punctul de îngrijire (POCT).) agenți infecțioși din afara spitalelor și laboratoarelor.În comparație cu diagnosticarea tradițională, consumatoare de timp, tehnologia microfluidică oferă economii de mostre și costuri pentru diagnosticarea moleculară în timpul focarelor de boală.Răspândirea globală a bolii coronavirus 2019 (COVID-19) este cauzată de sindromul respirator acut sever coronavirus 2 (SARS-CoV-2), astfel încât importanța microfluidicei pentru prevenirea și controlul în timp util al pandemiei este din nou subliniată [11, 12]. , 13].Spre deosebire de diagnosticarea tradițională, microfluidic POCT utilizează dispozitive portabile mici, de la analizoare de banc la benzi de testare laterale mici pentru a testa în apropierea punctului de prelevare [14].Aceste teste oferă o pregătire simplă sau fără eșantion, amplificare rapidă a semnalului și citiri sensibile ale semnalului, care au ca rezultat o durată scurtă și rezultate precise în câteva minute.Disponibilitatea și producția în masă a instrumentelor medicale bazate pe microfluidice și-au extins aplicațiile de diagnosticare directă și rentabile în afara spitalului, lângă pacient și chiar acasă.
Dintre strategiile existente de diagnosticare a bolilor infecțioase, diagnosticul molecular este una dintre cele mai sensibile [15, 16].În plus, diagnosticul molecular este adesea folosit ca standard de aur pentru detectarea continuă a COVID-19, permițând detectarea directă a regiunilor specifice virusului de ARN sau ADN înainte de debutul unui răspuns imun [17, 18].În revizuirea actuală, prezentăm cele mai recente progrese în procesele de diagnostic molecular bazate pe microfluidice pentru boli infecțioase, din perspectivă academică până în perspective industriale viitoare (Fig. 1).Vom începe cu trei pași cheie în detectarea acidului nucleic: pretratarea probei pe cip, amplificarea acidului nucleic și citirea semnalului.Am comparat apoi diferite tipuri de platforme microfluidice cu structura și funcția lor, prezentând caracteristici unice (puncte forte și puncte slabe).Detectarea digitală a acidului nucleic este discutată în continuare și dată ca exemplu de tehnologie de a treia generație pentru cuantificarea absolută a moleculelor de patogen infecțios.În plus, vor fi prezentate câteva dispozitive POCT tipice și cele mai recente comerciale pentru a demonstra starea actuală a pieței POCT microfluidice pentru diagnosticarea moleculară.De asemenea, vom discuta și explica viziunea noastră pentru aplicațiile viitoare.
Modulele de cipuri microfluidice pentru detectarea acidului nucleic pot fi împărțite în trei categorii (eșantionare, recunoaștere și semnalizare) în funcție de funcțiile lor [19].Printre aceste module, modulul de eșantionare realizează în principal liza probelor și extracția acidului nucleic.Modulul senzor controlează în principal conversia și amplificarea semnalelor de acid nucleic.Modulul de semnalizare detectează semnalul convertit și procesat de modulul de detectare.Pe baza procesului de detectare a acizilor nucleici pe un cip, vom rezuma diferitele cipuri care pot realiza funcția de „intrare și ieșire”.
Primul pas în detectarea acidului nucleic este extracția acidului nucleic, adică izolarea acidului nucleic țintă din proba originală.Extracția acidului nucleic este efectuată pentru a purifica acizii nucleici de alți contaminanți moleculari, pentru a asigura integritatea structurii primare a moleculelor de acid nucleic și pentru a optimiza rezultatele.Extracția acidului nucleic necesită liza probelor necesare și captarea acidului nucleic, a căror calitate și eficiență au un impact enorm asupra rezultatelor cercetării și diagnosticului.Orice reacții adverse subtile în timpul extracției pot limita detectarea ulterioară.De exemplu, metodele de reacție în lanț a polimerazei (PCR) și de amplificare izotermă în buclă (LAMP) sunt inhibate de unii solvenți organici reziduali, cum ar fi etanolul și izopropanolul din reactivii de izolare a acidului nucleic [20].Extracția lichid-lichid și extracția în fază solidă sunt cele mai populare metode pentru izolarea acizilor nucleici [21], cu toate acestea, extracția lichid-lichid pe un cip este extrem de limitată, deoarece reactivii utilizați în extracția lichid-lichid provoacă coroziunea majorității cipurilor microfluidice. .Aici, evidențiem metodele de extracție în fază solidă bazate pe microarray și comparăm avantajele și dezavantajele acestora.
Siliciul este un material substrat compatibil cu acizii nucleici datorită biocompatibilității, stabilității și ușurinței de modificare [22].Important, atunci când este modificat cu silice sau alte materiale, acest compozit prezintă proprietăți de a adsorbi acizi nucleici încărcați negativ în condiții de pH scăzut și săruri ridicate, în timp ce eluează cu soluții de pH ridicat și săruri scăzute.Pe baza acestui fenomen, este posibilă purificarea acidului nucleic.
Diverse forme de materiale pe bază de silice au fost utilizate pentru extracția acidului nucleic în microfluidice, cum ar fi mărgele de silice, pulberile, filtrele din microfibră și membranele de silice [23, 24, 25, 26].În funcție de proprietățile materialului, materialele pe bază de siliciu pot fi utilizate în microcircuite în moduri diferite.De exemplu, granulele de silice, pulberile și nanofiltrele comerciale pot fi pur și simplu plasate în porii sau microcanalele cipurilor microfluidice și pot ajuta la extragerea acizilor nucleici din probe [27, 28, 29].Membranele de silice modificate la suprafață pot fi, de asemenea, utilizate pentru a purifica rapid ADN-ul de agenți patogeni, la costuri reduse.De exemplu, Wang și colab.[30] Prin combinarea reacțiilor de amplificare de denaturare cu schimbul de lanț mediat de vezicule cu membrane de silice acoperite cu oligozaharide de chitosan, a fost introdus un sistem portabil versatil care a detectat cu succes 102-108 unități formatoare de colonii.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., iar prezența virusului era ușor vizibilă.Powell și colab.[31] Micromatricele pe bază de siliciu au fost apoi folosite pentru a detecta virusul hepatitei C (VHC), virusul imunodeficienței umane (HIV), virusul Zika și virusul papiloma uman și propagarea automată, în care a fost dezvoltat un microreactor sinuos de 1,3 μl pentru a captura virusurile ARN.și efectuează amplificarea in situ.În plus față de aceste metode, microcoloanele de silice modificate la suprafață joacă, de asemenea, un rol cheie în extracția acidului nucleic, deoarece geometria și proprietățile materialului de modificare cresc foarte mult eficiența extracției.Chen şi colab.[32] a propus o platformă microfluidică pentru izolarea ARN-ului cu concentrație scăzută bazată pe microcoloane de siliciu acoperite cu amino.Acest dispozitiv microfluidic integrează o serie de micropiloni de 0,25 cm2 pe un substrat de siliciu pentru a obține o eficiență mai mare de extracție printr-un design mare suprafață-volum.Avantajul acestui design este că dispozitivul microfluidic poate atinge o eficiență de extracție a acidului nucleic de până la 95%.Aceste strategii pe bază de siliciu demonstrează valoarea izolării rapide a acizilor nucleici la costuri reduse.În combinație cu cipurile microfluidice, strategiile de extracție pe bază de siliciu nu numai că pot crește eficiența detectării acidului nucleic, ci și pot facilita miniaturizarea și integrarea dispozitivelor analitice [20].
Metodele de separare magnetică folosesc particule magnetice pentru a izola acizii nucleici în prezența unui câmp magnetic extern.Particulele magnetice utilizate în mod obișnuit includ particulele magnetice Fe3O4 sau γ-Fe2O3 acoperite cu silice, amino și carboxil [33,34,35,36].Caracteristica distinctivă a particulelor magnetice în comparație cu metodele SPE pe bază de siliciu este ușurința de manipulare și control cu magneți externi.
Folosind interacțiunea electrostatică dintre acizii nucleici și silice, în condiții de sare ridicată și pH scăzut, acizii nucleici sunt adsorbiți pe suprafața particulelor magnetice acoperite cu silice, în timp ce în condiții de sare scăzută și pH ridicat, moleculele pot fi spălate. din nou..Granulele magnetice acoperite cu silice fac posibilă extragerea ADN-ului din probe de volum mare (400 μL) folosind mișcare controlată magnetic [37].Ca o demonstrație, Rodriguez-Mateos și colab.[38] au folosit magneți reglabili pentru a controla transferul margelelor magnetice în diferite camere.Pe baza particulelor magnetice acoperite cu silice, 470 de copii/mL de ARN genomic SARS-CoV-2 pot fi extrase din probe de apă uzată pentru detectarea transcripției inverse LAMP (RT-LAMP) și răspunsul poate fi citit în decurs de 1 oră.ochiul liber (Fig. 2a).
Dispozitive bazate pe materiale magnetice si poroase.Diagrama conceptuală a dispozitivului microfluidic IFAST RT-LAMP pentru detectarea ARN SARS-CoV-2 (adaptată din [38]).b Microdispozitiv centrifugal pentru dSPE de acid nucleic tampon bucal (adaptat din [39]).c Concentrator de probe autoalimentat încorporat folosind un card FTA® (adaptat de la [50]).d Hârtie de filtru Fusion 5 modificată cu chitosan (adaptată din [51]).SARS-CoV-2 sindrom respirator acut sever coronavirus 2, amplificare izotermă mediată prin bucla de transcripție inversă RT-LAMP, parteneri tehnologici FTA finders, acid nucleic NA
Particulele magnetice încărcate pozitiv sunt ideale pentru atașarea vertebratei fosfatice a unui acid nucleic.La o anumită concentrație de sare, grupările fosfat încărcate negativ ale acizilor nucleici pot fi încărcate pozitiv pe suprafața particulelor compozite magnetice.Prin urmare, pentru extracția acizilor nucleici au fost dezvoltate nanoparticule magnetice cu o suprafață rugoasă și o densitate mare de grupări amino.După separarea și blocarea magnetică, nanoparticulele magnetice și complexele de ADN pot fi utilizate direct în PCR, ceea ce elimină necesitatea operațiunilor de purificare și eluare complexe și consumatoare de timp [35].Nanoparticulele magnetice acoperite cu grupări carboxil negative au fost, de asemenea, folosite pentru a separa acizii nucleici adsorbiți pe suprafețe în soluții de polietilen glicol și clorură de sodiu cu concentrație mare [36].Cu aceste margele magnetice modificate la suprafață, extracția ADN-ului este compatibilă cu amplificarea ulterioară.Dignan și colab.[39] a descris o platformă microfluidică centrifugă automată și portabilă pentru pretratarea acidului nucleic, permițând personalului netehnic să o utilizeze la fața locului.În plus, compatibilitatea ADN-ului izolat cu LAMP, o metodă potrivită pentru analiza acidului nucleic la punctul de îngrijire, demonstrează în continuare cerințele minime de echipament și adecvarea pentru testele colorimetrice (Fig. 2b).
Metodele cu granule magnetice oferă posibilitatea extracției automate, dintre care unele există în extractoare comerciale automate de acid nucleic [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, SUA), QIAcube® HT;CapitalBio (Beijing, China) și Biomek®;Beckman (Miami, SUA).), Florida, SUA)].Avantajele combinării margelelor magnetice cu microfluidica pot fi utilizate pentru extracția automată eficientă a acizilor nucleici, care ar putea avansa dezvoltarea diagnosticului molecular;cu toate acestea, combinația de margele magnetice cu microfluidic se bazează încă în mare măsură pe sisteme de control complexe pentru manipularea precisă a margelelor magnetice, ceea ce explică popularitatea produselor comerciale fiind voluminoase și costisitoare, ceea ce limitează aplicarea ulterioară a margelelor magnetice în POCT.
Mai multe materiale poroase, cum ar fi filtre de nitroceluloză modificate, carduri Finders Technology Associates (FTA), hârtii de filtru pe bază de polietersulfonă și materiale acoperite cu glican au fost, de asemenea, utilizate pentru detectarea acidului nucleic [40, 41, 42, 43, 44].Materialele fibroase poroase, cum ar fi hârtia fibroasă, au fost folosite pentru a izola ADN-ul prin încurcarea fizică a moleculelor de ADN cu caten lung cu fibre.Porii mici duc la o restricție fizică puternică a moleculelor de ADN, care afectează pozitiv extracția ADN-ului.Datorită dimensiunilor diferite ale porilor hârtiei fibroase, eficiența extracției nu poate satisface nevoile de amplificare a ADN-ului [45, 46].Cardul FTA este o hârtie de filtru comercială utilizată în domeniul medicinei legale și utilizată pe scară largă în alte domenii ale diagnosticului molecular.Prin utilizarea hârtiei de filtru de celuloză impregnată cu diverse substanțe chimice pentru a liza membranele celulare din probă, ADN-ul eliberat este protejat de degradare până la 2 ani.Mai recent, hârtia de celuloză impregnată a fost dezvoltată pentru detectarea moleculară a diferiților agenți patogeni, inclusiv SARS-CoV-2, leishmanioza și malaria [47,48,49].HIV din plasma izolată este lizat direct, iar acidul nucleic viral este îmbogățit în membrana de flux FTA® încorporată în concentrator, ceea ce permite producerea eficientă a acidului nucleic [50] (Fig. 2c).Principala problemă cu detectarea acidului nucleic folosind cardurile FTA este că substanțele chimice precum guanidina și izopropanolul inhibă reacțiile de amplificare ulterioare.Pentru a rezolva această problemă, am dezvoltat hârtie de filtru Fusion 5 modificată cu chitosan, care combină atât avantajele întrețeserii fizice a moleculelor de ADN și hârtiei de filtru fibroase, cât și adsorbția electrostatică a ADN-ului pe compușii modificați cu chitosan pentru a obține o extracție extrem de eficientă a acidului nucleic. ..fibre filtrante [51] (Fig. 2d).În mod similar, Zhu și colab.[52] a demonstrat o metodă PCR modificată cu chitosan bazată pe un sistem microfluidic capilar in situ pentru izolarea și detectarea rapidă a ARN-ului virusului Zika.Acizii nucleici pot fi adsorbiți/desorbiți într-un mediu mixt de lizat/PCR, respectiv, pe baza proprietății de pornire/oprire a chitosanului.pornit și oprit”, receptiv la pH.
După cum sa menționat mai sus, aceste strategii combină avantajele diferitelor materiale în fază solidă și măresc eficiența extracției acidului nucleic în microfluidică.În aplicațiile practice, utilizarea acestor materiale în cantități mari este neeconomică, iar tratamentul adecvat al suprafeței sau modificarea suprafeței materialelor obișnuite cu aceste materiale le poate păstra, de asemenea, funcția.Prin urmare, se crede că implementarea acestor strategii după un studiu pilot poate reduce costurile.
Testarea acidului nucleic pe platforme microfluidice utilizează adesea volume mici de probă (< 100 µl), prin urmare necesită amplificarea acizilor nucleici țintă cu sonde specifice pentru conversie la un semnal care este convenabil pentru detectarea în aval (optică, electrică și magnetică) [53, 54]. Testarea acidului nucleic pe platforme microfluidice utilizează adesea volume mici de probă (< 100 µl), prin urmare necesită amplificarea acizilor nucleici țintă cu sonde specifice pentru conversie la un semnal care este convenabil pentru detectarea în aval (optică, electrică și magnetică) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. La testarea acizilor nucleici pe platforme microfluidice, sunt adesea utilizate volume mici de probă (<100 µL), astfel încât amplificarea acizilor nucleici țintă cu sonde speciale este necesară pentru a-l converti într-un semnal convenabil pentru detectarea ulterioară (optică, electrică și magnetică) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸 ， 以 转换 为 便于 下游 检测 （光学 、 电学 和 磁学） 的 信号 [53, 54 ]。微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 信号 [53, 54, 54, 54 ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Detectarea acizilor nucleici pe platforme microfluidice utilizează de obicei volume mici de probă (<100 μl), ceea ce necesită amplificarea acizilor nucleici țintă cu sonde speciale pentru a le converti în semnale pentru detectarea ulterioară (optică, electrică și magnetică) [53, 54]] .Amplificarea acidului nucleic în microfluidice poate, de asemenea, accelera reacțiile, optimiza limitele de detecție, reduce cerințele de eșantionare și îmbunătățește acuratețea detectării [55, 56].În ultimii ani, odată cu realizarea detecției rapide și precise, în microfluidică au fost aplicate diverse metode de amplificare a acidului nucleic, inclusiv PCR și unele reacții de amplificare izotermă.Această secțiune va rezuma metodele de detectare a acidului nucleic bazate pe sisteme microfluidice.
PCR este o simulare a procesului de replicare a ADN-ului unui organism, a cărui teorie este descrisă în detaliu în altă parte și nu va fi discutată aici.PCR poate amplifica o cantitate foarte mică de ADN/ARN țintă la o rată exponențială, făcând PCR un instrument puternic pentru detectarea rapidă a acizilor nucleici.În ultimele decenii, multe dispozitive microfluidice portabile echipate cu sisteme de ciclu termic PCR au fost dezvoltate pentru a răspunde nevoilor de diagnosticare la punctul de îngrijire [57, 58].PCR pe cip poate fi împărțită în patru tipuri (PCR convențională, cu flux continuu, comutată spațial și PCR convectivă) conform diferitelor metode de control al temperaturii [59].De exemplu, Gee et al.[60] au dezvoltat o metodă de PCR cantitativă cu transcripție inversă directă (RT-qPCR) pe propria platformă microfluidică pentru detectarea multiplex a virusurilor SARS-CoV-2, gripei A și B în probele de tampon de gât (Fig. 3a).Park și colab.[61] a construit un cip simplu de analiză a agenților patogeni prin integrarea PCR cu peliculă subțire, electrozi și un modul microfluidic pe bază de polidimetilsiloxan acţionat cu degetul.Cu toate acestea, ambele lucrări întruchipează deficiențele comune ale PCR convenționale.PCR necesită cicluri termice, ceea ce limitează miniaturizarea suplimentară a dispozitivului și reducerea timpului de testare.
Dezvoltarea PCR microfluidice și cu comutare în spațiu, bazată pe flux continuu, este esențială pentru a aborda această problemă.Folosind un canal serpentin lung sau un canal drept scurt, PCR cu flux continuu poate oferi o amplificare rapidă prin circulația activă a reactivilor în trei zone de preîncălzire cu o pompă off-chip.Această operație evită cu succes faza de tranziție între diferite temperaturi de reacție și astfel reduce semnificativ timpul de testare [62] (Fig. 3b).Într-un alt studiu al lui Jung și colab.[63] a propus un nou analizor genetic rotativ PCR care combină caracteristicile PCR fix și flux pentru PCR cu transcripție inversă ultrarapidă și multiplex (Fig. 3c).Pentru amplificarea acidului nucleic, microcipul PCR va fi rotit prin trei blocuri de încălzire la temperaturi diferite: 1. Bloc de denaturare 94°C, 2. Blocul de recoacere la 58°C, 3. Blocul de expansiune la 72°C.
Aplicarea PCR în microfluidică.Reprezentarea schematică a dirRT-qPCR pe o platformă microfluidică (adaptată din [60]).b Reprezentare schematică a unui microarray PCR cu flux continuu bazat pe un canal serpentin (adaptat din [62]).c Reprezentare schematică a unui analizor genetic rotativ PCR, format dintr-un microcip, trei blocuri de încălzire și un motor pas cu pas (adaptat din [63]).d Diagrama PCR prin termoconvecție cu centrifugare și setare (adaptată din [64]).DirRT-qPCR, reacție în lanț a polimerazei cu transcripție inversă cantitativă directă
Folosind capilare și bucle sau chiar plăci subțiri, PCR prin convecție poate amplifica rapid acizii nucleici prin convecție termică liberă naturală, fără a fi nevoie de o pompă externă.De exemplu, a fost dezvoltată o platformă microfluidică polimerică olefină ciclică pe o etapă de încălzire rotativă fabricată care utilizează ciclul termic cu centrifugare într-un microcanal de buclă PCR [64] (Fig. 3d).Soluția de reacție este condusă de convecția termică, care schimbă continuu temperaturi ridicate și scăzute într-un microcanal cu o structură inelară.Întregul proces de amplificare poate fi finalizat în 10 minute cu o limită de detecție de 70,5 pg/canal.
După cum era de așteptat, PCR rapidă este un instrument puternic pentru sistemele de diagnostic molecular și de analiză multiplex complet integrate cu răspunsul la probă.PCR rapidă reduce semnificativ timpul necesar pentru detectarea SARS-CoV-2, ceea ce contribuie la controlul eficient al pandemiei de COVID-19.
PCR necesită un termociclator complex care nu este potrivit pentru POCT.Mai recent, tehnicile de amplificare izotermă au fost aplicate la microfluidice, incluzând, dar fără a se limita la LAMP, amplificarea polimerazei recombinaze (RPA) și amplificarea bazată pe secvențe de acid nucleic [65,66,67,68].Cu aceste tehnici, acizii nucleici sunt amplificați la o temperatură constantă, facilitând crearea de dispozitive POCT portabile cu costuri reduse și foarte sensibile pentru diagnosticarea moleculară.
Testele LAMP bazate pe microfluidic de mare randament permit detectarea multiplă a bolilor infecțioase [42, 69, 70, 71].În combinație cu un sistem microfluidic centrifugal, LAMP poate facilita și mai mult automatizarea detectării acidului nucleic [69, 72, 73, 74, 75].SlipChip spin-and-react a fost dezvoltat pentru detectarea vizuală a mai multor bacterii paralele folosind LAMP [76] (Fig. 4a).Când se folosește LAMP optimizat în test, raportul semnal-zgomot de fluorescență a fost de aproximativ 5 ori, iar limita de detecție a atins 7,2 copii/μl de ADN genomic. Mai mult, existența a cinci agenți patogeni bacterieni digestivi comuni, inclusiv Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis și Vibrio parahaemolyticus, au fost vizualizate pe baza metodei în < 60 min. Mai mult, existența a cinci agenți patogeni bacterieni digestivi comuni, inclusiv Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis și Vibrio parahaemolyticus, au fost vizualizate pe baza metodei în < 60 min.Mai mult, prezența a cinci agenți patogeni bacterieni comuni ai tractului digestiv, inclusiv Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis și Vibrio parahaemolyticus, a fost vizualizată folosind această metodă în mai puțin de 60 de minute.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 存在 ， 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 沙门 氏 菌 、 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌。。 肠 沙门 氏 菌 、 河流 弧菌 和 副溶血性 副溶血性 弧菌。。 肠 沙门 氏 菌 、 河流 弧菌 和 副溶血性 副溶血性 弧菌。。 肠 沙门 氏 菌 、 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌 弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 ”弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPÎn plus, prezența a cinci agenți patogeni gastrointestinali bacterieni comuni, inclusiv Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius și Vibrio parahaemolyticus, a fost vizualizată folosind această metodă în mai puțin de 60 de minute.
Avantajele LAMP în microfluidică includ, printre altele, răspunsul rapid și detectarea miniaturizată.Cu toate acestea, din cauza temperaturii de reacție (aproximativ 70°C), aerosolii sunt generați inevitabil în timpul LAMP, rezultând o rată ridicată de fals pozitiv.Specificitatea testului, designul primerului și controlul temperaturii trebuie, de asemenea, optimizate pentru LAMP.În plus, modelele de cip care implementează detectarea mai multor ținte pe un singur cip sunt de mare valoare și ar trebui dezvoltate.În plus, LAMP este potrivită pentru detectarea multifuncțională integrată într-un singur cip, ceea ce este de mare importanță, dar există încă mult spațiu pentru dezvoltare.
Rata ridicată de fals pozitive a LAMP poate fi parțial redusă cu RPA, deoarece temperatura de reacție relativ scăzută (~37 °C) are ca rezultat relativ puține probleme de evaporare [77].În sistemul RPA, doi primeri opuși inițiază sinteza ADN prin legarea la o recombinază și amplificarea poate fi finalizată în 10 minute [78,79,80,81].Prin urmare, întregul proces RPA este mult mai rapid decât PCR sau LAMP.În ultimii ani, sa demonstrat că tehnologia microfluidică îmbunătățește și mai mult viteza și precizia RPA [82,83,84].De exemplu, Liu et al.[85] a dezvoltat un test de amplificare a polimerazei recombinazei cu flux lateral integrat microfluidic pentru detectarea rapidă și sensibilă a SARS-CoV-2 prin integrarea transcripției inverse RPA (RT-RPA) și a unui sistem universal de detectare a benzilor de testare a fluxului lateral.într-un singur sistem microfluidic.Figura 4b).Limita de detectare este de 1 copie/µl sau 30 de copii/probă, iar detectarea poate fi finalizată în aproximativ 30 de minute.Kong şi colab.au dezvoltat un dispozitiv microfluidic purtabil.[86] a folosit temperatura corpului și un sistem de detectare a fluorescenței bazat pe telefonul mobil pentru a detecta rapid și direct ADN-ul HIV-1 folosind RPA (Figura 4c).Testul RPA purtabil detectează 100 de copii/mL ale secvenței țintă în 24 de minute, demonstrând un potențial mare pentru diagnosticarea rapidă a sugarilor infectați cu HIV-1 în medii cu resurse limitate.
Amplificare izotermă în testarea la punctul de îngrijire (POCT).Dezvoltarea și producerea de spin și reacție SlipChip.După sudarea cu plasmă, așchiile de sus și de jos au fost asamblate cu un set de piulițe pentru a forma așchiul final (adaptat din [76]).b Schema sistemului MI-IF-RPA pentru detectarea COVID-19 (adaptată din [85]).c Schema unui test RPA purtabil pentru detectarea rapidă a ADN-ului HIV-1 (adaptat din [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxifluoresceină, virusul imunodeficienței umane HIV, RPA recombinaze polimerază amplificare, LED light emitting diode, MI-IF-RPA Low Integrated Microfluteraldic Polimerase Recombinase Amplificare
RPA pe bază de microfluidic se dezvoltă rapid, cu toate acestea, costul fabricării cipurilor și consumul de reacție este prea mare și trebuie redus pentru a crește disponibilitatea acestei tehnologii.În plus, sensibilitatea ridicată a RPA poate afecta amplificarea produselor nespecifice, în special în prezența contaminării.Aceste limitări pot afecta aplicarea RPA în sistemele microfluidice și merită o optimizare suplimentară.Primeri și sonde bine proiectate pentru diferite ținte sunt, de asemenea, necesari pentru a îmbunătăți fezabilitatea strategiilor microfluidice bazate pe RPA în POCT.
Cas13 și Cas12a au capacitatea de a scinda aleatoriu acizii nucleici și astfel pot fi dezvoltate ca instrumente de detectare și diagnosticare.Cas13 și Cas12a sunt activate la legarea la ADN-ul țintă sau, respectiv, la ARN.Odată activată, proteina începe să scinda alți acizi nucleici din apropiere, după care ARN-urile de ghidare care vizează acizii nucleici specifici patogenului pot scinda sondele fluorescente stinse și pot elibera fluorescența.Pe baza acestei teorii, Kellner et al.[87] a dezvoltat o metodă bazată pe Cas13 [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)] și Broughton și colab.[88] a dezvoltat o altă abordare bazată pe Cas12a [CRISPR Trans Reporter targeting DNA endonuclease (DTECR)].
În ultimii ani au apărut diverse metode de detecție a acizilor nucleici bazate pe CRISPR [89, 90].Metodele convenționale bazate pe CRISPR sunt adesea consumatoare de timp și de muncă din cauza procedurilor multiple, inclusiv extracția acidului nucleic, amplificarea și detectarea CRISPR.Expunerea lichidelor la aer poate crește șansa de rezultate fals pozitive.Având în vedere cele de mai sus, sistemele bazate pe CRISPR au nevoie urgentă de optimizare.
O platformă microfluidică controlată pneumatic care poate efectua 24 de analize în paralel a fost dezvoltată pentru aplicațiile de detecție CRISPR-Cas12a și CRISPR-Cas13a [91].Sistemul este echipat cu un dispozitiv de detectare a fluorescenței care ocolește amplificarea acidului nucleic și detectează automat probele de ADN și ARN femtomolar.Chen şi colab.[92] amplificarea recombinazei integrată cu sistemul CRISPR-Cas12a în microfluidica centrifugă (Fig. 5a).Această lucrare depășește dificultatea integrării acestor două procese, deoarece Cas12a poate digera ADN-ul mesager și poate inhiba procesul de amplificare.În plus, Chen și colab.[92] a pre-depozitat în plus reactivii de reacție într-un control microfluidic centrifugal pentru a finaliza automat întregul proces.Într-o altă lucrare, Silva și colab.[93] a dezvoltat o metodă de diagnosticare fără amplificare CRISPR/Cas12a și un smartphone pentru a detecta SARS-CoV-2 (Fig. 5b).Acest test, cunoscut sub numele de sistem fără amplificare bazat pe telefonul mobil, include o enzimă dependentă de CRISPR/Cas care se bazează pe vizualizarea de pe smartphone a semnalelor bule generate de catalază în canalele microfluidice.Detectare sensibilă a mai puțin de 50 de copii/µl de acid nucleic fără pre-amplificare, întregul proces de la injectarea probei până la citirea semnalului durează doar 71 de minute.
Metode de detectare a acidului nucleic bazate pe CRISPR.POCT centrifugal pentru diagnosticul molecular integrat bazat pe CRISPR (adaptat din [92]).b Dezvoltarea testului CASCADE pentru analiza SARS-CoV-2 bazată pe smartphone-uri (adaptat din [93]).Amplificarea recombinazei RAA, motivul protospacer adiacent PAM, repetări palindromice scurte grupate CRISPR la intervale regulate, sistem CASCADE fără amplificare prin telefon mobil cu enzime dependente de CRISPR/CAS, clorhidrat de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimidă EDC
Ca ultimul pas în detectarea acidului nucleic, detectarea semnalului reflectă în mod direct rezultatele diagnosticului și este un factor critic în dezvoltarea unui POCT eficient, sensibil și precis.Semnalele pot fi citite folosind diverse metode, cum ar fi strategii fluorescente, electrochimice, colorimetrice și magnetice.În această secțiune, descriem rațiunea fiecărei abordări și comparăm diagnosticul molecular al bolilor infecțioase în microfluidică.
Strategiile bazate pe fluorescență sunt utilizate pe scară largă pentru diagnosticarea POCT a bolilor infecțioase datorită avantajelor lor remarcabile de sensibilitate excelentă, cost scăzut, ușurință de operare și analiză la punctul de îngrijire [94, 95].Aceste strategii folosesc fluorofori marcați, cum ar fi coloranții fluorescenți și nanomaterialele pentru a crea un semnal detectabil (îmbunătățirea fluorescenței sau stingerea).Această descoperire sugerează că strategiile bazate pe fluorescență pot fi împărțite în etichetare fluorescentă directă, detectie fluorescentă cu semnal activat și semnal-off [96].Detectarea directă a etichetei fluorescente folosește etichete fluorescente speciale pentru a marca liganzi specifici care generează o anumită cantitate de fluorescență atunci când sunt legați selectiv de o țintă.Pentru detectarea fluorescenței pe bază de semnal, calitatea semnalului fluorescent este legată pozitiv de mărimea interesului.Intensitatea fluorescenței este neglijabilă în absența unei ținte și este detectabilă atunci când este prezentă o cantitate suficientă de țintă.Dimpotrivă, intensitatea fluorescenței detectată prin fluorescența „semnal-off” este invers proporțională cu cantitatea de țintă, atingând inițial o valoare maximă și scăzând treptat pe măsură ce ținta este mărită.De exemplu, folosind mecanismul de trans-clivare dependent de țintă CRISPR-Cas13a, Tian și colab.[97] a dezvoltat o nouă strategie de recunoaștere pentru a detecta ARN-urile care ocolesc direct transcripția inversă (Fig. 6a).La legarea de ARN-uri țintă complementare, complexul CRISPR-Cas13-ARN poate fi activat, declanșând clivajul transcolateral de către ARN-uri reporter nespecifici.Reporterul marcat fluorescent [fluorofor (F)] este stins de stingerea (Q) intact și fluoresce atunci când este scindat de complexul activat.
Avantajul detectării electrochimice este viteza mare de detectare, producția ușoară, costul scăzut, ușor de transportat și controlul automat.Este o metodă analitică puternică pentru aplicațiile POCT.Pe baza tranzistoarelor cu efect de câmp din grafen Gao și colab.[98] a dezvoltat un nanobiosenzor pentru detectarea multiplex a antigenelor bolii Lyme din bacteriile Borrelia burgdorferi cu o limită de detecție de 2 pg/mL (Fig. 6b).
Testele colorimetrice au fost utilizate în aplicațiile POCT, beneficiind de avantajele portabilității, costului redus, ușurinței de pregătire și citirii vizuale.Detectarea colorimetrică poate folosi oxidarea peroxidazei sau a nanomaterialelor asemănătoare peroxidazei, agregarea nanomaterialelor și adăugarea de coloranți indicatori pentru a converti informațiile despre prezența acizilor nucleici țintă în modificări vizibile de culoare [99, 100, 101].În special, nanoparticulele de aur sunt utilizate pe scară largă în dezvoltarea strategiilor colorimetrice și, datorită capacității lor de a induce schimbări rapide și semnificative de culoare, există un interes din ce în ce mai mare pentru dezvoltarea platformelor colorimetrice POCT pentru diagnosticarea in situ a bolilor infecțioase [102].Cu un dispozitiv microfluidic centrifugal integrat [103], agenții patogeni de origine alimentară din probele de lapte contaminat pot fi detectați automat la nivelul a 10 celule bacteriene, iar rezultatele pot fi citite vizual în 65 de minute (Fig. 6c).
Tehnicile de detectare magnetică pot detecta cu precizie analiții folosind materiale magnetice și a existat un interes semnificativ pentru aplicațiile POCT în ultimele decenii.Tehnicile de detectare magnetică au câteva avantaje unice, cum ar fi materialele magnetice cu costuri reduse, mai degrabă decât componentele optice scumpe.Cu toate acestea, utilizarea unui câmp magnetic îmbunătățește eficiența detectării și reduce timpul de pregătire a probei [104].În plus, rezultatele sondajului magnetic demonstrează specificitate ridicată, sensibilitate și raport ridicat semnal-zgomot datorită semnalului de fond magnetic nesemnificativ al probelor biologice [105].Sharma și colab.a integrat un biosenzor bazat pe joncțiunea tunelului magnetic într-o platformă portabilă cu microcip.[106] pentru detectarea multiplex a agenților patogeni (Fig. 6d).Biosenzorii detectează sensibil acizii nucleici subnanomolari izolați de agenți patogeni.
Metodă tipică de detectare a semnalului.Conceptul de detectare hiperlocalizată a Cas13a (adaptat din [97]).b Nanobiosenzor FET de grafen în combinație cu Lyme GroES scFv (adaptat din [98]).c Indicații colorimetrice pentru detectarea multiplex a agenților patogeni de origine alimentară într-un cip microfluidic centrifugal: probele nr. 1 și nr. 3 cu agenți patogeni țintă și probele nr. 2, nr. 4 și nr. 5 fără agenți patogeni țintă (adaptat din [103]) .d Biosenzor bazat pe o joncțiune de tunel magnetic, incluzând o platformă, un amplificator de blocare încorporat, o unitate de control și o sursă de alimentare pentru generarea/achiziția de semnal (adaptat din [106]).GFET Grafen FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polimetil metacrilat
În ciuda caracteristicilor excelente ale metodelor de detectare de mai sus, acestea au încă dezavantaje.Aceste metode sunt comparate (tabelul 1), inclusiv unele aplicații cu detalii (pro și contra).
Odată cu dezvoltarea microfluidicei, sistemelor microelectromecanice, nanotehnologiei și științei materialelor, utilizarea cipurilor microfluidice pentru detectarea bolilor infecțioase este în continuă dezvoltare [55,96,107,108].Manipularea precisă a echipamentelor și fluidelor miniaturale contribuie la acuratețea diagnosticului și la rentabilitatea.Prin urmare, pentru dezvoltarea ulterioară, s-au făcut eforturi pentru optimizarea și modernizarea cipurilor, rezultând diverse cipuri microfluidice cu structuri și funcții diferite.Aici prezentăm pe scurt câteva tipuri comune de platforme microfluidice și comparăm caracteristicile acestora (pro și contra).În plus, majoritatea exemplelor enumerate mai jos se concentrează în primul rând pe combaterea SARS-CoV-2.
LOCC-urile sunt cele mai comune sisteme analitice complexe miniaturizate, iar operațiunile lor sunt foarte miniaturizate, integrate, automatizate și paralelizate de la injectarea și prepararea probei, controlul fluxului și detectarea lichidului [109, 110].Lichidele sunt manipulate printr-o geometrie atent proiectată și prin interacțiunea multor efecte fizice, cum ar fi gradienții de presiune, acțiunea capilară, electrodinamica, câmpurile magnetice și undele acustice [111].LOCC prezintă avantaje excelente în screening-ul cu randament ridicat și detectarea multiplă, cu viteză rapidă de analiză, dimensiune mică a eșantionului, consum redus de energie și eficiență ridicată de gestionare și operare;cu toate acestea, dispozitivele LOCC sunt foarte delicate, iar producția, ambalarea și interfața.Cu toate acestea, multiplexarea și reutilizarea se confruntă cu dificultăți enorme [96].În comparație cu alte platforme, LOCC are avantaje unice în ceea ce privește diversitatea maximă a aplicațiilor și cea mai bună compatibilitate tehnologică, dar și dezavantajele sale sunt evidente, și anume complexitatea ridicată și repetabilitatea slabă.Dependența de pompele externe, care sunt adesea voluminoase și costisitoare, limitează și mai mult utilizarea lor în POCT.
În timpul focarului de COVID-19, LOCC a primit multă atenție.În același timp, există câteva cipuri noi care combină mai multe tehnologii.De exemplu, smartphone-urile sunt acum utilizate pe scară largă ca dispozitive portabile de analiză și au un mare potențial pentru integrarea LOCC.Sun și colab.[21] a fabricat un cip microfluidic care permite multiplexarea secvențelor specifice de acid nucleic a cinci agenți patogeni, inclusiv SARS-CoV-2, folosind LAMP și le-a analizat folosind un smartphone în termen de 1 oră de la sfârșitul reacției.Ca un alt exemplu, Sundah et al.[112] a creat un comutator molecular [amplificare catalitică prin comutator de stare de tranziție moleculară (CATCH)] pentru detectarea directă și sensibilă a țintelor ARN SARS-CoV-2 folosind smartphone-uri. CATCH este compatibil cu LOCC portabil și atinge performanțe superioare (aproximativ 8 copii ARN/μl; < 1 oră la temperatura camerei) [112]. CATCH este compatibil cu LOCC portabil și atinge performanțe superioare (aproximativ 8 copii ARN/μl; < 1 oră la temperatura camerei) [112]. CATCH сов suс îl с п портаuter cord, locc ianuarie и оеспечивает „ CATCH este compatibil cu LOCC portabil și oferă un randament excelent (aproximativ 8 copii ARN/µl; < 1 oră la temperatura camerei) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 ARN 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 ARN 拷贝/μl；室温下< 1 小时）[112]。 CATCH сов suсprezece с портаuter cord, locc и оладаеuter превосходной производительностюю (пoрирно 8 копий к к2]. CATCH este compatibil cu LOCC-uri portabile și are performanțe excelente (aproximativ 8 copii ARN/µl; < 1 oră la temperatura camerei) [112].În plus, dispozitivele LOCC pentru diagnosticarea moleculară utilizează, de asemenea, unele forțe motrice, cum ar fi vacuum, întindere și câmpuri electrice.Kang şi colab.[113] a demonstrat o PCR cu nanoplasmă pe cip ultra-rapidă în timp real pentru diagnosticarea rapidă și cantitativă a COVID-19 în teren folosind un cip PCR lichid plasmonic în vid.Li şi colab.[114] a dezvoltat ulterior un cip microfluidic condus de întindere care a permis diagnosticarea COVID-19.Platforma folosește sistemul de amplificare RT-LAMP pentru a determina dacă o probă este calitativ pozitivă sau negativă.Ulterior, Ramachandran et al.[115] a obținut gradienți corespunzători de câmp electric folosind izotachoforeza (ITP), o tehnică de focalizare selectivă a ionilor implementată în microfluidică.Cu ITP, ARN-ul țintă din probele brute de tampon nazofaringian poate fi purificat automat.Apoi Ramachandran și colab.[115] Combinând această purificare ITP cu testele LAMP și CRISPR îmbunătățite cu ITP, s-a detectat SARS-CoV-2 în tampon nazofaringian uman și specimene clinice în aproximativ 35 de minute.În plus, idei noi apar în mod constant.Jadhav și colab.[116] a propus o schemă de diagnosticare bazată pe spectroscopie Raman îmbunătățită la suprafață în combinație cu un dispozitiv microfluidic care conține fie nanotuburi de carbon acoperite cu aur/argint orientate vertical, fie micro/nanotuburi electrofilate de unică folosință.Microcanalele de filtru încorporate funcționalizate cu membrană sunt de unică folosință.Dispozitivul adsorb virușii din diferite fluide/exsudații corporale, cum ar fi saliva, nazofaringe și lacrimi.Astfel, titrul virusului este abundent și virusul poate fi identificat cu precizie prin semnătura Raman.
LOAD este o platformă microfluidică centrifugă în care toate procesele sunt controlate printr-un protocol de frecvență care rotește un substrat microstructurat [110].Dispozitivul LOAD se caracterizează prin utilizarea forței centrifuge ca forță motrice importantă.Lichidele sunt, de asemenea, supuse forțelor capilare, Euler și Coriolis.Folosind un dispozitiv de centrifugare, analizele sunt efectuate în funcționare lichidă continuă, de la o poziție radială spre interior spre exterior, eliminând nevoia de tuburi externe suplimentare, pompe, actuatoare și supape active.Pe scurt, o singură metodă de control simplifică operarea.Forțele care acționează asupra lichidului din același canal microfluidic la aceeași distanță de centrul de sarcină sunt egale, ceea ce face posibilă repetarea structurii canalului.Astfel, echipamentul LOAD este mai simplu și mai economic de proiectat și fabricat decât echipamentul LOCC convențional, în timp ce reacțiile sunt în mare măsură independente și paralelizate;totuși, datorită rezistenței mecanice ridicate a echipamentelor centrifuge, materialul de așchii disponibil este limitat și volumele mici sunt dificile.la mașină.În același timp, majoritatea dispozitivelor LOAD sunt proiectate doar pentru o singură utilizare, ceea ce este costisitor pentru detectarea la scară largă [96, 117, 118, 119].
În ultimele decenii, LOAD, considerat unul dintre cele mai promițătoare dispozitive microfluidice, a primit o atenție considerabilă din partea cercetătorilor și producătorilor.Astfel, LOAD a câștigat o largă acceptare și a fost utilizat pentru diagnosticarea moleculară a agenților patogeni infecțioși [120, 121, 122, 123, 124], în special în timpul focarului de COVID-19.De exemplu, la sfârșitul anului 2020, Ji și colab.[60] a demonstrat un test direct RT-qPCR pentru detectarea paralelă rapidă și automată a infecțiilor cu SARS-CoV-2 și gripa A și B în probele de tampon de gât.Apoi Xiong și colab.[74] a prezentat o platformă microfluidică discoidă integrată în LAMP pentru detectarea rapidă, precisă și simultană a șapte coronavirusuri respiratorii umane, inclusiv SARS-CoV-2, în decurs de 40 de minute.La începutul anului 2021, de Oliveira et al.[73] a demonstrat un cip microfluidic centrifugal cu toner din polistiren, acţionat manual cu un rotator cu vârful degetului, pentru diagnosticul molecular RT-LAMP al COVID-19.Ulterior, Dignan et al.[39] a prezentat un microdispozitiv de centrifugă portabil automatizat pentru purificarea ARN-ului SARS-CoV-2 direct din secțiuni de tampon bucal.Medved şi colab.[53] a propus un sistem inline de prelevare a aerosolilor SARS-CoV-2 cu un cip fluorescent microfluidic rotativ de volum mic, cu o limită de detecție de 10 copii/μL și un prag minim de ciclu de 15 minute.Suarez şi colab.[75] a raportat recent dezvoltarea unei platforme microfluidice centrifuge modulare integrate pentru detectarea directă a ARN-ului SARS-CoV-2 în probe de tampon nazofaringian inactivate termic folosind LAMP.Aceste exemple demonstrează marile beneficii și promisiunea LOAD în diagnosticarea moleculară a COVID-19.
În 1945, Muller și Clegg [125] au prezentat pentru prima dată canale microfluidice pe hârtie folosind hârtie de filtru și parafină.În 2007, grupul Whitesides [126] a creat prima platformă funcțională de hârtie pentru testarea proteinelor și a glucozei.Hârtia a devenit un substrat ideal pentru microfluidică.Hârtia are proprietăți inerente, cum ar fi hidrofilitatea și structura poroasă, biocompatibilitate excelentă, greutate redusă, flexibilitate, pliere, cost redus, ușurință în utilizare și comoditate.µPAD-urile clasice constau din structuri hidrofile/hidrofobe construite pe substraturi de hârtie.În funcție de structura tridimensională, μPAD-urile pot fi împărțite în μPAD-uri bidimensionale (2D) și tridimensionale (3D).µPAD-urile 2D sunt produse prin formarea granițelor hidrofobe pentru a forma canale microfluidice, în timp ce µPAD-urile 3D sunt de obicei realizate din stive de straturi de hârtie microfluidă 2D, uneori prin plierea hârtiei, tehnici de alunecare, canale deschise și imprimare 3D [96].Fluidele apoase sau biologice de pe μPAD sunt controlate în primul rând de forța capilară fără o sursă de alimentare externă, facilitând depozitarea prealabilă a reactivilor, manipularea probelor și detectarea multiplex.Cu toate acestea, controlul precis al debitului și detectarea multiplex sunt îngreunate de viteza insuficientă de detectare, sensibilitate și reutilizare [96, 127, 128, 129, 130].
Ca o platformă microfluidică neobișnuită, μPAD a fost promovată și dezvoltată pe scară largă pentru diagnosticul molecular al bolilor infecțioase precum HCV, HIV și SARS-CoV-2 [131, 132].Pentru detectarea selectivă și sensibilă a VHC, Tengam și colab.[133] a dezvoltat un biosenzor nou bazat pe hârtie fluorescentă utilizând o sondă de acid nucleic foarte specifică bazată pe peptida pirolidinil.Acizii nucleici sunt imobilizați covalent pe hârtie de celuloză parțial oxidată prin alchilare reductivă între grupările amino și grupările aldehidice, iar detectarea se bazează pe fluorescență.Aceste semnale pot fi citite de un gadget special realizat cu o cameră fluorescentă portabilă în combinație cu o cameră pentru telefonul mobil.Ulterior, Lu et al.[134] a proiectat un electrod flexibil pe hârtie bazat pe nanoparticule de nichel/aur/nanotuburi de carbon/polivinil alcool organometalic pentru detectarea țintei HIV prin hibridizarea ADN-ului folosind albastru de metilen ca indicator redox ADN.Mai recent, Chowdury et al.[135] a prezentat un design ipotetic de platformă pentru testarea µPAD la punctul de îngrijire folosind saliva brută a pacientului în combinație cu LAMP și tehnologia de imagistică portabilă pentru detectarea analiților COVID-19.
Testele de curgere laterală ghidează fluidele prin forțe capilare și controlează mișcarea fluidului prin umecbilitatea și caracteristicile substraturilor poroase sau microstructurate.Dispozitivele de curgere laterală constau din probă, conjugat, incubator și detecție și tampoane absorbante.Moleculele de acid nucleic din LFA recunosc lianți specifici care sunt pre-depozitați la locul de legare și se leagă ca complexe.Pe măsură ce lichidul trece prin plăcile de incubare și detecție, complexele sunt captate de moleculele de captare situate pe liniile de testare și control, arătând rezultate care pot fi citite direct cu ochiul liber.De obicei, LFA poate fi finalizat în 2-15 minute, ceea ce este mai rapid decât descoperirea tradițională.Datorită mecanismului special, LFA necesită puține operațiuni și nu necesită echipamente suplimentare, ceea ce îl face foarte ușor de utilizat.Este ușor de fabricat și miniaturizat, iar costul substraturilor pe bază de hârtie este mai mic.Cu toate acestea, este folosit doar pentru analiză calitativă, iar detectarea cantitativă este foarte dificilă, iar capacitatea de multiplexare și debitul sunt foarte limitate și doar un singur acid nucleic poate fi detectat la un moment dat [96,110,127].
Deși majoritatea aplicațiilor LFA sunt concentrate pe imunotestele, utilizarea LFA pentru diagnosticarea moleculară în cipurile microfluidice este, de asemenea, eficientă și populară [136].În cazul virusului hepatitei B, HIV și SARS-CoV-2 LFA Gong și colab.[137] a propus o platformă LFA de nanoparticule de conversie ascendentă și a demonstrat versatilitatea acestei platforme miniaturizate și portabile prin detectarea sensibilă și cantitativă a țintelor multiple, cum ar fi acidul nucleic HBV.În plus, Fu și colab.[138] a demonstrat un nou LFA bazat pe spectroscopie Raman îmbunătățită la suprafață pentru analiza cantitativă a ADN-ului HIV-1 la concentrații scăzute.Pentru detectarea rapidă și sensibilă a SARS-CoV-2, Liu și colab.[85] a dezvoltat o analiză a fluxului lateral RPA integrat cu microfluidic, combinând RT-RPA și un sistem universal de detectare a fluxului lateral într-un singur sistem microfluidic.
Aplicarea diferitelor platforme microfluidice variază în funcție de studiile specifice, profitând din plin de capacitățile și avantajele platformelor.Cu supape, pompe și conducte la prețuri accesibile, LOCC este cea mai cuprinzătoare platformă pentru diversitatea aplicațiilor și interoperabilitatea cu cel mai mare spațiu de dezvoltare.De aceea, sperăm și recomandăm ca cele mai noi studii să fie efectuate la LOCC ca primă încercare și să fie optimizate condițiile.În plus, metode mai eficiente și mai precise sunt de așteptat să fie descoperite și utilizate în sistem.LOAD excelează în controlul precis al fluidelor de la dispozitivele LOCC existente și demonstrează avantaje unice în acționările unice prin forță centrifugă, fără a fi nevoie de unități externe, în timp ce răspunsurile paralele pot fi separate și sincronizate.Astfel, în viitor, LOAD va deveni principala platformă microfluidică cu mai puține operațiuni manuale și tehnologii mai mature și automatizate.Platforma µPAD combină beneficiile LOCC și ale materialelor pe bază de hârtie pentru diagnosticare cu costuri reduse, de unică folosință.Prin urmare, dezvoltarea viitoare ar trebui să se concentreze pe tehnologii convenabile și bine stabilite.În plus, LFA este foarte potrivit pentru detectarea cu ochiul liber, promițând să reducă consumul de probe și să accelereze detectarea.O comparație detaliată a platformei este prezentată în Tabelul 2.
Analizele digitale împart proba în mai multe microreactoare, fiecare dintre ele conține un număr discret de molecule țintă [139, 140].Testele digitale oferă avantaje semnificative pentru efectuarea cuantificării absolute prin efectuarea a mii de experimente biochimice paralele simultan și individual în compartimente la scară de microni, mai degrabă decât într-o fază continuă.În comparație cu microfluidica tradițională, reacțiile de compartiment pot reduce volumul probei, pot crește eficiența reacției și pot fi integrate cu ușurință cu alte metode analitice fără a fi nevoie de canale, pompe, supape și design compact [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Următoarele două metode sunt utilizate în testele digitale pentru a obține o separare uniformă și precisă a soluțiilor, inclusiv reactivi și probe precum celule, acizi nucleici și alte particule sau molecule: (1) emulsii de picătură care exploatează instabilitatea interfeței lichide;(2) diviziunea matricei este efectuată de constrângerile geometrice ale dispozitivului.În prima metodă, picăturile care conțin reactivi și probe în microcanale pot fi create prin metode pasive, cum ar fi co-curent, flux încrucișat, focalizare în flux, emulsionare în etape, emulsionare microcanal și membrane prin forțe de forfecare vâscoase și emulsionare cu schimbarea canalului.localizare [143, 145, 146, 148, 149] sau folosind metode active [150, 151], care introduc energie suplimentară prin control electric, magnetic, termic și mecanic.În această din urmă abordare, cea mai bună uniformitate a volumului fluidului în camerele microfluidice este împărtășită prin păstrarea structurilor spațiale de aceeași dimensiune, cum ar fi microgropi și matrice de suprafață [152,153,154].În special, picăturile sunt secțiuni majore de flux care pot fi, de asemenea, generate și manipulate pe rețele de electrozi bazate pe microfluidice digitală (DMF).Electroumezitarea dielectricilor este una dintre cele mai bine studiate teorii DMF, deoarece electroumezitarea dielectricilor permite manipularea precisă a picăturilor individuale, controlând forma lichidului și semnalele electrice asimetrice care trec prin diferite părți [141, 144].Principalele operațiuni cu picături în DMF includ sortarea, împărțirea și îmbinarea [151, 155, 156], care pot fi aplicate în diverse domenii de analiză, în special în detectarea moleculară [157, 158, 159].
Detectarea digitală a acidului nucleic este o tehnologie de diagnostic molecular de a treia generație care urmează PCR convențională și PCR cantitativă în timp real (qPCR), în paralel cu secvențierea de mare capacitate și biopsia lichidă.În ultimele două decenii, acizii nucleici digitali s-au dezvoltat rapid în domeniul diagnosticului molecular al agenților patogeni infecțioși [160, 161, 162].Cuantificarea absolută a detectării digitale a acidului nucleic începe cu împachetarea probelor și a reactivilor în compartimente individuale pentru a se asigura că fiecare secvență țintă are aceeași probabilitate de a intra în fiecare compartiment individual.Teoretic, fiecărei secțiuni i se pot atribui mai multe secvențe țintă sau este posibil să nu existe un sistem de microreacție independent.Prin diferitele mecanisme de detectare descrise mai sus, compartimentele cu secvențe țintă microbiene care generează semnale peste un anumit prag pot fi vizualizate cu ochiul liber sau de către o mașină și sunt etichetate ca pozitive, în timp ce alte compartimente care generează semnale sub prag sunt etichetate ca pozitive. .negative, care fac semnalul pentru fiecare secțiune un boolean.Astfel, prin calcularea numărului de compartimente create și a ratei rezultatelor pozitive după reacție, copiile originale ale probelor de testat pot fi comparate folosind formula de distribuție Poisson fără a fi nevoie de o curbă standard, care este necesară pentru analizele cantitative de rutină, cum ar fi ca qPCR.[163] În comparație cu metodele tradiționale de diagnosticare moleculară, detectarea digitală a acidului nucleic are un grad mai mare de automatizare, viteză și sensibilitate mai mare de analiză, mai puțini reactivi, mai puțină contaminare și o proiectare și fabricare mai simple.Din aceste motive, utilizarea testelor digitale, în special a metodelor bazate pe picături, pentru diagnosticarea moleculară, combinând tehnici de amplificare și citire a semnalului, a fost bine studiată în timpul focarului critic de SARS-CoV-2.De exemplu, Yin și colab.[164] a combinat metode digitale cu picături și PCR rapidă pentru a detecta genele ORF1ab, N și RNase P în SARS-CoV-2 într-un cip microfluidic.În special, sistemul a reușit să identifice un semnal pozitiv în 115 secunde, ceea ce este mai rapid decât PCR convențional, indicând eficacitatea acestuia în detectarea la punctul de îngrijire (Figura 7a).Dong şi colab.[165], Sow și colab.[157], Chen şi colab.[166] și Alteri și colab.[167] a aplicat și PCR digitală cu picături (ddPCR) pentru a detecta SARS-CoV-2 într-un sistem microfluidic, cu rezultate impresionante.Pentru a îmbunătăți și mai mult rata de detectare, Shen și colab.[168] a realizat imagistica cu cip bazată pe ddPCR în doar 15 s fără utilizarea tehnicilor de îmbinare a imaginii, accelerând procesul tehnologic ddPCR de la laborator la aplicație.Nu se aplică doar metode de amplificare termică, cum ar fi PCR, ci și metode de amplificare izotermă sunt utilizate pentru a simplifica condițiile de reacție și răspunsul rapid.Lu şi colab.[71] a dezvoltat SlipChip pentru analiza picăturilor, capabil să genereze picături de diferite dimensiuni la densități mari într-o singură etapă și să cuantifice acizii nucleici SARS-CoV-2 folosind LAMPĂ digitală (Figura 7b).Fiind o tehnologie cu evoluție rapidă, CRISPR poate juca, de asemenea, un rol important în detectarea digitală a acidului nucleic prin imagini colorimetrice convenabile, fără a fi nevoie de pete suplimentare de acid nucleic.Ackerman şi colab.a dezvoltat o reacție combinatorie de matrice pentru evaluarea multiplex a acizilor nucleici.[158] a detectat 169 de viruși asociați omului, inclusiv SARS-CoV-2, în picături care conțin reactivi de detectare a acidului nucleic pe bază de CRISPR-Cas13 într-un test cu microgodeuri (Figura 7c).În plus, amplificarea izotermă și tehnologia CRISPR pot fi folosite în același sistem pentru a combina beneficiile ambelor.Park și colab.[169] Un test digital CRISPR/Cas12a a fost dezvoltat într-un cip microfluidic comercial pentru detectarea SARS-CoV-2 extras și ucis prin căldură, bazat pe un RT-RPA cu o singură etapă, cu o detecție semnal la fundal mai scurtă și mai mare. raportul de timp., interval dinamic mai larg și sensibilitate mai bună (Fig. 7d).Câteva descrieri ale acestor exemple sunt prezentate în Tabelul 3.
Platformă digitală tipică pentru detectarea acidului nucleic.a Fluxul de lucru PCR digital rapid constă din patru pași cheie: pregătirea probei, distribuția amestecului de reacție, procesul de amplificare și cuantificarea țintei (adaptat din [164]).b Schemă care arată analiza picăturilor SlipChip pentru formarea picăturilor la densitate mare (adaptată din [71]).c Diagrama fluxului de lucru CARMEN-Cas13 (adaptată din [158]).d Prezentare generală a detectării digitale avansate a virușilor cu CRISPR/Cas într-un singur vas (adaptat din [169]).W/O apă-în-ulei, polidimetilsiloxan PDMS, reacție în lanț a polimerazei PCR, colectare de date DAQ, derivat integral proporțional PID, reacție matrice combinativă CARMEN pentru evaluarea multiplex a acidului nucleic, SARS-CoV-2, sindrom respirator acut sever, coronavirus 2 , RT Amplificarea transcriptază inversă recombinază polimerază-RPA, semnal S/B în fundal
Ora postării: 15-sept-2022
