Știri

Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Metodele de etichetare a proximității enzimatice bazate pe esteri activați sau radicali fenoxi sunt utilizate pe scară largă pentru a mapa proteoame subcelulare și interactori de proteine ​​din celulele vii.Cu toate acestea, esterii activați sunt mai puțin reactivi, rezultând o rază largă de marcare, iar radicalii fenoxi generați de tratarea cu peroxid pot interfera cu căile redox.Aici raportăm o metodă de fotoactivare dependentă de etichetare de proximitate (PDPL) dezvoltată prin legarea genetică a proteinei fotosensibilizatoare miniSOG la o proteină de interes.Declanșat de lumina albastră și controlat de timpul de expunere, se generează oxigen singlet și apoi se realizează marcarea reziduurilor de histidină rezolvată spațiotemporal de către sonda de anilină.Demonstrăm fidelitatea sa înaltă prin maparea proteomelor specifice organelor.O comparație paralelă a PDPL cu TurboID arată o acoperire proteomică mai specifică și mai cuprinzătoare a PDPL.Apoi, am aplicat PDPL la coactivatorul transcripțional BRD4 și E3 Parkin ligaza asociat bolii și am găsit interactori necunoscuți anterior.Prin screeningul supraexpresiei, au fost identificate două substraturi necunoscute, Ssu72 și SNW1, pentru Parkin, a cărei degradare este mediată de calea ubiquitinare-proteazom.
Caracterizarea precisă a rețelelor de proteine ​​stă la baza multor procese celulare fundamentale.Prin urmare, cartografierea spațio-temporală foarte precisă a interacțiunilor proteinelor va oferi o bază moleculară pentru descifrarea căilor biologice, patologiei bolii și perturbarea acestor interacțiuni în scopuri terapeutice.În acest scop, metodele capabile să detecteze interacțiuni temporale în celulele sau țesuturile vii sunt foarte de dorit.Spectrometria de masă cu purificare prin afinitate (AP-MS) a fost folosită istoric pentru a identifica partenerii de legare ai proteinelor de interes (POI).Odată cu dezvoltarea metodelor de proteomică cantitativă, a fost creată Bioplex3.0, cea mai mare bază de date de rețele de proteine ​​bazate pe AP-MS.Deși AP-MS este foarte puternic, etapele de liză și diluare a celulelor din fluxul de lucru sunt părtinitoare către interacțiuni de legare slabe și tranzitorii și introduc artefacte post-liză, cum ar fi perechile de interacțiuni false care nu au compartimentare înainte de liză.
Pentru a rezolva aceste probleme, au fost dezvoltați aminoacizi nenaturali (UAA) cu grupuri de reticulare și platforme enzimatice de etichetare în apropiere (PL) (de exemplu, APEX și BioID)5.Deși metoda UAA a fost aplicată cu succes în multe scenarii și oferă informații despre adezivi proteici direcți, optimizarea locului de inserție a UAA este încă necesară.Mai important, este o metodă de etichetare stoichiometrică care nu are o inversare catalitică a evenimentelor de etichetare.Spre deosebire de aceasta, metodele enzimatice PL, cum ar fi metoda BioID, fuzionează biotin ligaza proiectată cu POI7, care activează ulterior biotina pentru a forma un intermediar ester biotinil-AMP reactiv.Astfel, enzima catalizează și eliberează un „nor” de biotină activat care etichetează reziduurile proximale de lizină.Cu toate acestea, BioID necesită mai mult de 12 ore pentru a obține un semnal etichetat suficient, ceea ce împiedică utilizarea acestuia cu rezoluție temporală.Folosind evoluția direcționată bazată pe afișarea drojdiei, TurboID a fost proiectat pe baza BioID pentru a fi mai eficient, permițând etichetarea eficientă cu biotină în decurs de 10 minute, permițând studierea proceselor mai dinamice.Deoarece TurboID este foarte activ și nivelurile de biotină endogene sunt suficiente pentru etichetarea la nivel scăzut, etichetarea de fundal devine o problemă potențială atunci când este necesară o etichetare foarte îmbunătățită și temporizată prin adăugarea de biotină exogenă.În plus, esterii activați sunt slab reactivi (t1/2 ~ 5 min), ceea ce poate duce la o rază mare de marcare, în special după saturarea proteinelor învecinate cu biotină 5. Într-o altă abordare, fuziunea genetică a peroxidazei ascorbat modificate (adică biotina- radicalii fenol și permite marcarea proteinelor în decurs de un minut9, 10. APEX este utilizat pe scară largă pentru a identifica proteoame subcelulare, complexe de proteine ​​​​membranare și complexe de proteine ​​​​de semnalizare citosolică 11, 12. Cu toate acestea, nevoia de concentrații mari de peroxizi poate afecta proteinele sau căile redox, perturbând procesele celulare.
Astfel, o nouă metodă capabilă să genereze specii de suprimare a razei marcate mai reactive, cu o precizie spațială și temporală ridicată, fără a perturba semnificativ căile celulare, va fi un plus important la metodele existente. Dintre speciile reactive, oxigenul singlet ne-a trezit atenția datorită duratei de viață scurte și razei de difuzie limitate (t1/2 < 0,6 µs în celule)13. Dintre speciile reactive, oxigenul singlet ne-a trezit atenția datorită duratei de viață scurte și razei de difuzie limitate (t1/2 < 0,6 µs în celule)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Dintre formele active, oxigenul singlet ne-a atras atenția datorită duratei de viață scurte și razei de difuzie limitate (t1/2 < 0,6 µs în celule)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0,6 µs 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Printre formele active, oxigenul singlet ne atrage atenția datorită duratei de viață scurte și a razei de difuzie limitate (t1/2 < 0,6 μs în celule).S-a raportat că oxigenul singlet oxidează aleatoriu metionina, tirozina, histidina și triptofanul, făcându-l polar 14,15 pentru atașarea la sonde pe bază de amine sau tiol16,17.Deși oxigenul singlet a fost folosit pentru a marca ARN-ul subcelular al compartimentului, strategiile de reutilizare a markerilor de proximitate POI endogeni rămân neexplorate.Aici, prezentăm o platformă numită etichetare de proximitate dependentă de fotoactivare (PDPL), în care folosim lumină albastră pentru a ilumina POI-urile fuzionate cu un fotosensibilizator miniSOG și declanșăm generarea de oxigen singlet pentru a oxida reziduurile proximale, urmată de modificări care conțin amine pentru a oxida sondele chimice în celule vii intermediare..Am testat un grup de sonde chimice pentru a maximiza specificitatea etichetei și am identificat site-uri de modificare folosind un flux de lucru de proteomică deschis.O comparație paralelă a PDPL cu TurboID arată o acoperire proteomică mai specifică și mai cuprinzătoare a PDPL.Am aplicat această abordare la markerii specifici de organele ai proteomului subcelular și la identificarea proteomului general a partenerilor de legare pentru proteina de reglare epigenetică asociată cancerului BRD4 și E3 ligaza Parkin asociată bolii Parkinson, care a confirmat atât o rețea cunoscută, cât și una necunoscută de proteine. interacțiuni..Capacitatea PDPL de a recunoaște substraturile E3 în complexe mari de proteine ​​reprezintă o situație în care este necesară recunoașterea lianților indirecți.Două substraturi necunoscute de parkin mediate de ubiquitinare-proteazom au fost confirmate in situ.
Terapia fotodinamică (PDT)19 și inactivarea cu laser asistată de cromofori (CALI)20, în care iradierea luminii cu fotosensibilizatori generează oxigen singlet, pot inactiva proteinele țintă sau pot provoca moartea celulelor.Deoarece oxigenul singlet este o substanță foarte reactivă, cu o distanță de difuzie teoretică de aproximativ 70 nm, oxidarea limitată spațial în jurul fotosensibilizatorului poate fi controlată.Pe baza acestui concept, am decis să folosim oxigen singlet pentru a obține o etichetare strânsă a complexelor proteice din celulele vii.Am dezvoltat o abordare chemoproteomică PDPL pentru a îndeplini patru funcții: (1) pentru a cataliza generarea de oxigen singlet activ similar cu abordarea enzimatică PL;(2) să ofere etichetare rezolvată în timp la inițierea luminii;(3) prin modificare (4) Evitați utilizarea cofactorilor endogeni (cum ar fi biotina) pentru a reduce fondul sau utilizați reactivi exogeni extrem de perturbatori (cum ar fi peroxizii) pentru a minimiza expunerea celulelor la stresul mediului.
Fotosensibilizatorii pot fi împărțiți în două categorii, inclusiv fluorofori cu greutate moleculară mică (de exemplu trandafir bengal, albastru de metilen)22 și proteine ​​mici codificate genetic (de exemplu miniSOG, KillerRed)23.Pentru a realiza un design modular, am dezvoltat platforma PDPL de prima generație prin adăugarea de proteine ​​fotosensibilizatoare (PS) la POI24,25 (Figura 1a).Când este iradiat cu lumină albastră, oxigenul singlet oxidează reziduurile de aminoacizi nucleofile proximale, rezultând o polaritate umpolung care este electrofilă și poate reacționa în continuare cu nucleofilii sondei amină16,17.Sonda este proiectată cu un mâner alchinic pentru a permite chimie clic și trage în jos pentru caracterizarea LC/MS/MS.
Ilustrare schematică a etichetării complexelor proteice mediate de miniSOG.Când sunt expuse la lumină albastră, celulele care exprimă miniSOG-POI generează oxigen singlet, care modifică proteinele care interacționează, dar nu și proteinele care nu se leagă.Produșii intermediari de fotooxidare sunt interceptați de etichetele releu ale sondei chimice amină pentru a forma aducti covalenti.Gruparea alchinil de pe sonda chimică permite chimie clic pentru îmbogățire prin derulare, urmată de cuantificare LC-MS/MS.b Structura chimică a sondelor aminice 1-4.c Analiza reprezentativă a gelului fluorescent a markerilor proteomici mediați de miniSOG localizați mitocondriali utilizând sondele 1-4 și cuantificarea relativă pe baza densitometriei pe gel.Raportul semnal-fond al sondelor chimice a fost evaluat folosind experimente de control negativ, excluzând lumina albastră sau folosind celule HEK293T fără expresie miniSOG.n = 2 probe biologic independente.Fiecare punct reprezintă o replică biologică.d Detectarea și cuantificarea reprezentativă a PDPL folosind sonda optimizată 3 în prezența sau absența componentelor PDPL indicate, cum ar fi c.n = 3 probe biologic independente.Fiecare punct reprezintă o replică biologică.Liniile centrale și mustățile reprezintă media și abaterea standard ±.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Imagistica confocală a oxigenului singlet cu colorare Si-DMA roșu îndepărtat.Bară de scară: 10 µm.Imagistica cu gel și experimentele confocale au fost repetate independent de cel puțin două ori, cu rezultate similare.
Am testat mai întâi capacitatea fotosensibilizatorilor maturi miniSOG26 și KillerRed23, exprimați stabil în HEK293T, de a media marcarea cu propargilamină a proteomului ca sondă chimică (Figura 1a suplimentară).Analiza fluorescenței pe gel a arătat că marcarea întregului proteom a fost realizată folosind miniSOG și iradierea cu lumină albastră, în timp ce nu a fost observat niciun produs de marcare vizibil cu KillerRed.Pentru a îmbunătăți raportul semnal-fond, am testat apoi un set de sonde chimice care conțineau anilină (1 și 3), propilamină (2) sau benzilamină (4).Am observat că celulele HEK293T în sine au avut un semnal de fundal mai mare în comparație cu nicio lumină albastră, posibil din cauza fotosensibilizatorului endogen de riboflavină, mononucleotida de flavină (FMN) 27 . Sondele chimice pe bază de anilină 1 și 3 au oferit o specificitate mai bună, HEK293T exprimând stabil miniSOG în mitocondrii afișând o creștere de >8 ori a semnalului pentru sonda 3, în timp ce sonda 2 utilizată în metoda de etichetare ARN CAP-seq afișând doar ~2,5- creșterea semnalului de ori, probabil datorită preferințelor diferite de reactivitate între ARN și proteină (Fig. 1b, c). Sondele chimice pe bază de anilină 1 și 3 au oferit o specificitate mai bună, HEK293T exprimând stabil miniSOG în mitocondrii afișând o creștere de >8 ori a semnalului pentru sonda 3, în timp ce sonda 2 utilizată în metoda de etichetare ARN CAP-seq afișând doar ~2,5- creșterea semnalului de ori, probabil datorită preferințelor diferite de reactivitate între ARN și proteină (Fig. 1b, c).Sondele chimice pe bază de anilină 1 și 3 au arătat o specificitate mai bună: HEK293T, care exprimă stabil miniSOG în mitocondrii, prezintă o creștere de peste 8 ori a semnalului pentru sonda 3, în timp ce sonda 2, utilizată în metoda de etichetare a ARN-ului CAP-seq, doar arată o creștere a semnalului de ~ 2,5 ori, probabil datorită preferințelor diferite de reactivitate între ARN și proteină (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 的 ， ， hek293t 在 线 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 而 用 于 于 标记 方法 CAP-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 MINISOG ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 于 标记 CAP-EQ 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNASondele chimice pe bază de anilină 1 și 3 au avut o specificitate mai bună, HEK293T a exprimat stabil miniSOG în mitocondrii, iar sonda 3 a avut o creștere de peste 8 ori a semnalului, în timp ce sonda 2 pentru metoda de etichetare a ARN-ului CAP-seq a arătat o creștere de numai ~ 2,5 ori.în semnal, probabil datorită preferințelor diferite de reacție între ARN și proteină (Fig. 1b, c).În plus, au fost testați izomerii sondei 3 și sondele de hidrazină (sondele 5, 6, 7), confirmând optimizarea sondei 3 (Fig. 1b, c suplimentară).În mod similar, analiza fluorescenței în gel a dezvăluit alți parametri experimentali optimizați: lungimea de undă de iradiere (460 nm), concentrația sondei chimice (1 mM) și timpul de iradiere (20 min) (Figura suplimentară 2a-c).Omiterea oricărei componente sau pas în protocolul PDPL a dus la inversarea semnificativă a semnalului în fundal (Fig. 1d).În special, marcarea proteinelor a fost redusă semnificativ în prezența azidei de sodiu sau a troloxului, despre care se știe că stinge oxigenul singlet.Prezența D2O, despre care se știe că stabilizează oxigenul singlet, îmbunătățește semnalul de etichetare.Pentru a investiga contribuția altor specii reactive de oxigen la etichetare, s-au adăugat manitol și vitamina C pentru a stabili captatorii de radicali hidroxil și, respectiv, superoxid 18, 29, dar nu s-a găsit că reduc etichetarea.Adăugarea de H2O2, dar nu iluminarea, nu a dus la etichetare (Fig. 3a suplimentară).Imagistica fluorescentă a oxigenului singlet cu sonde Si-DMA a confirmat prezența oxigenului singlet în firul HEK293T-miniSOG, dar nu și în firul original HEK293T.În plus, mitoSOX Red nu a putut detecta producția de superoxid după iluminare (Fig. 1e și Fig. 3b suplimentară) 30. Aceste date sugerează cu tărie că oxigenul singlet este principala specie reactivă de oxigen responsabilă pentru etichetarea proteomică ulterioară.Citotoxicitatea PDPL a fost evaluată incluzând iradierea cu lumină albastră și sonde chimice și nu a fost observată nicio citotoxicitate semnificativă (Fig. 4a suplimentară).
Pentru a studia mecanismul de etichetare și a permite identificarea proteomică a complexelor proteice folosind LC-MS/MS, trebuie mai întâi să determinăm ce aminoacizi sunt modificați și masa delta a etichetelor sondei.S-a raportat că metionina, histidina, triptofanul și tirozina sunt modificate de oxigenul singlet14,15.Integram fluxul de lucru TOP-ABPP31 cu căutarea deschisă imparțială oferită de platforma de calcul FragPipe bazată pe MSFragger32.După modificarea oxigenului singlet și marcarea sondei chimice, s-a efectuat chimia cu clic folosind o etichetă de reducere a biotinei care conține un linker scindabil, urmată de întindere cu neutravidină și digestia cu tripsină.Peptida modificată, încă legată de rășină, a fost fotoclivată pentru analiza LC-MS/MS (Figura 2a și Date suplimentare 1).Un număr mare de modificări au avut loc în proteom, cu peste 50 de potriviri cu hărți peptidice (PSM) enumerate (Fig. 2b).În mod surprinzător, am observat doar modificarea histidinei, probabil datorită reactivității mai mari a histidinei oxidate față de sondele de anilină decât alți aminoacizi.Conform mecanismului publicat de oxidare a histidinei prin oxigen singlet,21,33 structura delta-masă propusă de +229 Da corespunde aductului sondei 3 cu 2-oxo-histidină după două oxidări, în timp ce +247 Da este produsul de hidroliză. de +229 Da (Fig. 5 suplimentară).Evaluarea spectrului MS2 a arătat o fiabilitate ridicată a identificării majorității ionilor y și b, inclusiv identificarea ionilor de fragment modificați (y și b) (Fig. 2c).Analiza contextului secvenței locale a histidinelor modificate cu PDPL a dezvăluit o preferință moderată de motiv pentru reziduurile hidrofobe mici la poziții ± 1 (Figura suplimentară 4b).În medie, au fost identificate 1,4 histidine per proteină, iar locurile acestor markeri au fost determinate prin analiza suprafeței accesibile solventului (SASA) și a disponibilității relative a solvenților (RSA) (Figura suplimentară 4c, d).
Un flux de lucru imparțial pentru studierea selectivității reziduale utilizând platforma de calcul FragPipe alimentată de MSFragger.Linkerii clivabili sunt utilizați în chimia Click pentru a permite fotoclivarea peptidelor modificate din rășina streptavidină.A fost lansată o căutare deschisă pentru a identifica numeroase modificări, precum și rămășițe relevante.b Atribuiți masa modificărilor care au loc în proteom.Cartografierea peptidelor PSM.c Adnotarea spectrală MS2 a situsurilor histidinei modificate cu sonda 3. Ca exemplu reprezentativ, o reacție covalentă cu sonda 3 a adăugat +229,0938 Da la aminoacidul modificat.d Test de mutație utilizat pentru a testa markerii PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) și PRDX1 (H10A, H81A, H169A) au fost transfectate cu plasmide de tip sălbatic pentru detectarea anti-Flag.e Peptida sintetică a reacţionat cu miniSOG purificat în prezenţa sondei 3 şi produsele corespunzătoare cu Δm +247 şi +229 au fost notate în spectrul LC-MS.f Interacțiuni proteină-proteină in vitro modelate cu eticheta miniSOG-6xHis și anticorp anti-6xHis.Antibiotină (streptavidin-HRP) și analiză Western blot anti-șoarece a complexelor de anticorpi miniSOG-6xHis/anti-6xHis marcate cu sonda 3, în funcție de timpul de expunere la lumină.Etichetele pentru proteinele individuale sunt exprimate în greutatea moleculară corespunzătoare: lanț ușor al anticorpului LC, lanț greu al anticorpului HC.Aceste experimente au fost repetate independent de cel puțin două ori cu rezultate similare.
Pentru verificarea biochimică a locului de etichetare, PRDX3 și PRDX1 identificate prin spectrometrie de masă au fost modificate de la histidină la alanină și comparate cu tipul sălbatic în testele de transfecție.Rezultatele PDPL au arătat că mutația a redus semnificativ etichetarea (Fig. 2d).Între timp, secvențele de peptide identificate în căutarea deschisă au fost sintetizate și au reacționat in vitro cu miniSOG purificat în prezența sondei 3 și a luminii albastre, obținând produse cu o deplasare a masei de +247 și +229 Da atunci când sunt detectate prin LC-MS (Fig. .2e).).Pentru a testa dacă proteinele proximale care interacționează ar putea fi etichetate in vitro ca răspuns la fotoactivarea miniSOG, am proiectat un test de proximitate artificial prin interacțiunea între proteina miniSOG-6xHis și un anticorp monoclonal anti-His in vitro (Figura 2f).În acest test, ne așteptam etichetarea proximală a lanțurilor grele și ușoare de anticorpi cu miniSOG.De fapt, anti-șoarece (recunoscând lanțurile grele și ușoare ale anticorpului etichetat anti-6xHis) și Western blot-uri cu streptavidină au arătat o biotinilare puternică a lanțurilor grele și ușoare.În special, am observat autobiotinilarea miniSOG din cauza etichetei 6xHis și a legăturilor încrucișate dintre lanțurile ușoare și grele, care pot fi legate de decalajul descris anterior între răspunsul proximal de lizină și 2-oxo-histidină.În concluzie, concluzionăm că PDPL modifică histidina într-o manieră dependentă de proximitate.
Următorul nostru obiectiv a fost să caracterizăm proteomul subcelular pentru a testa specificitatea etichetării in situ.Prin urmare, am exprimat stabil miniSOG în nucleul, matricea mitocondrială sau membrana exterioară ER a celulelor HEK293T (Fig. 3a).Analiza fluorescenței pe gel a dezvăluit benzi marcate abundente în trei locații subcelulare, precum și modele diferite de etichetare (Fig. 3b).Analiza imagistică prin fluorescență a arătat o specificitate ridicată a PDPL (Fig. 3c).Fluxul de lucru PDPL a fost urmat de reacții de clic cu coloranți de rodamină pentru a delimita proteomii subcelulari folosind microscopia cu fluorescență, iar semnalele PDPL au fost colocalizate cu DAPI, trackere mitocondriale sau trackere ER, confirmând fidelitatea ridicată a PDPL.Pentru cele trei locații de organele, o comparație alăturată a PDPL cu TurboID utilizând avidină Western blot a arătat că PDPL a fost etichetat mai specific în comparație cu controalele respective.În condiții PDPL, au apărut mai multe benzi marcate, indicând mai multe proteine ​​marcate cu PDPL (Figura suplimentară 6a-d).
o Reprezentare schematică a etichetării proteomului specific organitelor mediate de miniSOG.miniSOG vizează matricea mitocondrială prin fuziune cu cei 23 de aminoacizi N-terminal ai COX4 uman (mito-miniSOG), nucleul prin fuziune cu H2B (nucleus-miniSOG) și Sec61β prin partea citoplasmatică a membranei ER (ER-miniSOG). ).Indicațiile includ imagistica pe gel, imagistica confocală și spectrometria de masă.b Imagini de gel reprezentative ale trei profile PDPL specifice organelelor.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Imagini confocale reprezentative ale celulelor HEK293T care exprimă stabil miniSOG cu diferite localizări subcelulare detectate de anticorpul marcat V5 (roșu).Markerii subcelulari sunt utilizați pentru mitocondrii și ER (verde).Fluxul de lucru PDPL include detectarea proteomilor subcelulari marcați cu miniSOG (galben) utilizând chimia clicului Cy3-azide.Bară de scară: 10 µm.d Grafice vulcanice ale proteomilor marcați cu PDPL în diverse organite cuantificate prin cuantificare neetichetată (n = 3 experimente biologice independente).Testul t Student cu două cozi a fost folosit pe parcelele vulcanilor.Tipul sălbatic HEK293T a fost utilizat ca martor negativ. Proteinele modificate semnificativ sunt evidențiate cu roșu (p < 0,05 și diferență de intensitate ionică > de 2 ori). Proteinele modificate semnificativ sunt evidențiate cu roșu (p < 0,05 și diferență de intensitate ionică > de 2 ori). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интосни в интесон). Proteinele modificate semnificativ sunt evidențiate cu roșu (p < 0,05 și diferență de > 2 ori în intensitatea ionilor).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в исница в ионлной). Proteinele modificate semnificativ sunt evidențiate cu roșu (p < 0,05 și > diferență de 2 ori în puterea ionică).Proteinele înrudite importante pentru HEK293T-miniSOG, dar nu importante pentru HEK293T sunt prezentate în verde.e Analiza specificității seturilor de date proteomice din experimente d.Numărul total de proteine ​​semnificative statistic din fiecare organelă (puncte roșii și verzi) este marcat în partea de sus.Histogramele arată proteine ​​localizate în organite bazate pe MitoCarta 3.0, analiza GO și A. Ting și colab.oameni.Seturi de date separate pentru mitocondrii, nuclee și ER.Aceste experimente au fost repetate independent de cel puțin două ori cu rezultate similare.Datele brute sunt furnizate sub formă de fișiere de date brute.
Încurajată de rezultatele gelului și imaginilor, cuantificarea fără etichetă a fost utilizată pentru a cuantifica proteomul identificat în fiecare organilă (Date suplimentare 2).HEK293T netransfectat a fost folosit ca control negativ pentru a scădea markerii de fundal. Analiza diagramei vulcanilor a afișat proteine ​​​​imbogățite semnificativ (p < 0,05 și > 2 ori intensitatea ionilor), precum și proteine ​​singleton care sunt prezente numai în liniile care exprimă miniSOG (Fig. 3d puncte roșii și verzi). Analiza diagramei vulcanilor a afișat proteine ​​​​imbogățite semnificativ (p < 0,05 și > 2 ori intensitatea ionilor), precum și proteine ​​singleton care sunt prezente numai în liniile care exprimă miniSOG (Fig. 3d puncte roșii și verzi). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Analiza diagramei vulcanilor a arătat proteine ​​îmbogățite semnificativ (p<0, 05 și > 2 ori intensitatea ionilor), precum și proteine ​​unice care sunt prezente numai în liniile care exprimă miniSOG (Fig. 3d, puncte roșii și verzi).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅 存 在于 minisog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 和 绿色点）。。。。。。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Analiza diagramei vulcanului a dezvăluit proteine ​​îmbogățite semnificativ (p<0,05 și >2x putere ionică), precum și proteine ​​unice prezente numai în linia de expresie miniSOG (puncte roșii și verzi în Fig. 3d).Combinând aceste date, am identificat 1364, 461 și 911 proteine ​​nucleare, mitocondriale și, respectiv, ale membranei exterioare ER semnificative statistic.Pentru a analiza acuratețea PDPL localizată în organele, am folosit MitoCarta 3.0, analiza Gene Ontology (GO) și A. Ting și colab.un set de date8 a fost utilizat pentru mitocondrii, nucleu și ER pentru a testa specificitatea organelelor proteinelor detectate, corespunzând unei acuratețe de 73,4, 78,5 și 73,0% (Fig. 3e).Specificitatea PDPL confirmă faptul că PDPL este un instrument ideal pentru identificarea proteomilor specifici organelelor.În special, analiza submitocondrială a proteinelor mitocondriale identificate a arătat că proteomul prins a fost distribuit în principal în matrice și în membrana interioară (226 și, respectiv, 106), reprezentând 91,7% (362) din numărul total de proteine ​​mitocondriale identificate.a fost confirmat suplimentar un nivel ridicat de PDPL (Fig. 7a suplimentară).În mod similar, analiza subnucleară a arătat că proteomul capturat a fost distribuit în principal în nucleu, nucleoplasmă și nucleol (Fig. 7b suplimentară).Analiza proteomică nucleară cu o peptidă semnal de localizare nucleară (3xNLS) a arătat o acuratețe similară cu constructul H2B (fig. 7c–h suplimentară).Pentru a determina specificul markerului PDPL, laminina nucleară A a fost aleasă ca o capcană POI7 localizată mai discret.PDPL a identificat 36 de proteine ​​îmbogățite semnificativ, dintre care 12 proteine ​​(30,0% inclusiv lamina A) au fost proteine ​​bine caracterizate care interacționează cu lamina A, adnotate de baza de date String, cu un procent mai mare decât metoda BioID (122 proteine) 28 din 28. , 22,9 %) 7. Metoda noastră a identificat mai puține proteine, posibil din cauza zonelor limitate de marcare, ceea ce a fost posibil prin oxigen singlet mai activ.Analiza GO a arătat că proteinele identificate au fost localizate în principal în nucleoplasmă (26), membrana nucleară (10), membrana nucleară (9) și porii nucleari (5).În mod colectiv, aceste proteine ​​localizate nuclear au reprezentat 80% din proteinele îmbogățite, demonstrând și mai mult specificitatea PDPL (Figura suplimentară 8a-d).
După ce a stabilit capacitatea PDPL de a efectua marcarea de proximitate în organele, am testat apoi dacă PDPL ar putea fi utilizat pentru a analiza partenerii de legare a POI.În special, am căutat să definim analiza PDPL a proteinelor citosolice, care sunt considerate ținte mai dificile decât omologii lor localizați pe membrană datorită naturii lor extrem de dinamice.Proteina bromodominală și extraterminală (BET) BRD4 ne-a atras atenția pentru rolul său cheie în diferite boli 35, 36.Complexul format de BRD4 este un coactivator transcripțional și o țintă terapeutică importantă.Prin reglarea expresiei factorilor de transcripție c-myc și Wnt5a, BRD4 este considerat a fi un determinant cheie al leucemiei mieloide acute (AML), mielomului multiplu, limfomului Burkitt, cancerului de colon și bolilor inflamatorii37,38.În plus, unii viruși vizează BRD4 pentru a regla transcripția virală și celulară, cum ar fi papilomavirusul, HIV și SARS-CoV-236,39.
Pentru a mapa interacțiunea BRD4 folosind PDPL, am combinat miniSOG cu o izoformă scurtă N- sau C-terminală a BRD4.Rezultatele proteomice au evidențiat un grad ridicat de suprapunere între cele două construcții (Fig. 9a suplimentară).Proteomul nuclear identificat cu miniSOG-H2B acoperă 77,6% din proteinele care interacționează cu BRD4 (Fig. 9b suplimentară).Apoi, s-au folosit diferiți timpi de iluminare (2, 5, 10, 20 min) pentru a ajusta raza markerului (Fig. 4a și datele suplimentare 3).Concluzionăm că la fotoperioade mai scurte, PDPL va eticheta în primul rând partenerii de legare directă, în timp ce perioadele mai lungi vor include proteinele identificate în timpul perioadelor mai scurte de fotoactivare, precum și ținte indirecte în complexele de marcare.De fapt, am găsit o suprapunere puternică între punctele de timp adiacente (84,6% pentru 2 și 5 min; 87,7% pentru 5 și 10 min; 98,7% pentru 10 și 20 min) (Fig. 4b și Fig. 9c suplimentară).În toate grupurile experimentale, am găsit nu numai autoetichetarea BRD4, ci și mai multe ținte cunoscute, cum ar fi MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A și HMGB1 adnotate în baza de date cu șiruri.Puterea ionică a acestor ținte este proporțională cu timpul de expunere (Fig. 4c și Fig. 9d suplimentară).Analiza GO a proteinelor identificate în grupul de 2 minute a arătat că proteinele identificate au fost localizate în nucleu și au fost implicate în remodelarea cromatinei și în funcția ARN polimerazei.Funcția moleculară a proteinei a fost îmbogățită în legarea cromatinei sau coactivarea transcripțională, în concordanță cu funcția BRD4 (Fig. 4d).Analiza interacțiunii proteinelor cu baze de date cu șiruri a dezvăluit un prim nivel de interacțiuni indirecte între complexele de interacțiune ale familiei BRD4 și HDAC, cum ar fi SIN3A, NCOR2, BCOR și SAP130 (Fig. 4e și Fig. 9e suplimentară), în concordanță cu histonele acetilate care leagă BRD4 și HDAC. ..În plus, țintele reprezentative identificate prin LC-MS/MS, inclusiv Sin3A, NSUN2, Fus și SFPQ, au fost confirmate prin Western blot (Fig. 4f).Recent, s-a raportat că izoforma scurtă a BRD4 formează nuclee cu proprietăți de separare a fazelor lichid-lichid (LLPS).Proteinele de legare a ARN Fus și SFPQ mediază LLPS-ul diferitelor procese celulare și au fost identificate aici ca proteine ​​de legare BRD4 neînregistrate.Interacțiunea dintre BRD4 și SFPQ a fost confirmată prin experimente de co-imunoprecipitare (co-IP) (Figura 4g), sugerând un alt mecanism pentru separarea fazei lichid-lichid mediată de BRD4 care merită investigații suplimentare.Luate împreună, aceste rezultate sugerează că PDPL este o platformă ideală pentru identificarea BRD4 cunoscută care interacționează, precum și a proteinelor de legare necunoscute.
a Reprezentare schematică a marcajului de proximitate BRD4 mediat de miniSOG, timpi de expunere: 2, 5, 10 și 20 min.b Suprapunerea proteinelor identificate la diferiți momente de iluminare.Îmbogățirea proteinelor identificată în HEK293T-miniSOG-BRD4 a fost semnificativă statistic în comparație cu HEK293T de tip sălbatic.c Intensitatea ionilor la cuantificarea proteinelor cunoscute de legare la BRD4 reprezentative nemarcate în timpul perioadei de expunere specificate.n = 3 probe biologic independente.Datele sunt prezentate ca medie ± abatere standard.d Analiza ontologică genetică (GO) a proteinelor identificate în grupul de 2 minute.Sunt listați primii zece termeni GO.Bulele sunt colorate în funcție de categoria de termeni GO, iar dimensiunea bulelor este proporțională cu numărul de proteine ​​găsite în fiecare termen.e Analiza șirurilor de proteine ​​care interacționează cu BRD4.Cercurile galbene sunt lipici direct, iar cercurile gri sunt primul strat de lipici indirect.Liniile roșii reprezintă interacțiunile determinate experimental, iar liniile albastre reprezintă interacțiunile prezise.f Țintele de legare reprezentative ale BRD4 identificate în LC-MS/MS au fost verificate prin Western blot.g Experimentele de co-imunoprecipitare confirmă interacțiunea dintre SFPQ și BRD4.Aceste experimente au fost repetate independent de cel puțin două ori cu rezultate similare.Datele brute sunt furnizate sub formă de fișiere de date brute.
Pe lângă identificarea țintelor asociate POI neînregistrate, presupunem că PDPL va fi potrivit pentru identificarea substraturilor pentru enzime, ceea ce ar necesita caracterizarea proteinelor de legare indirectă în complexe mari pentru a adnota substraturi neînregistrate.Parkina (codificată de PARK2) este o ligază E3 și se știe că mutațiile parkinului cauzează boala Parkinson juvenilă autosomal recesiv (AR-JP)42.În plus, parkinul a fost descris ca fiind esențial pentru mitofagie (autofagie mitocondrială) și îndepărtarea speciilor reactive de oxigen.Cu toate acestea, deși au fost identificate mai multe substraturi de parkin, rolul parkinului în această boală rămâne neclar.Pentru a adnota substraturile sale necaracterizate, PDPL a fost testat prin adăugarea miniSOG la capătul N- sau C-terminal al parkinului.Celulele au fost tratate cu m-clorofenilhidrazonă (CCCP) transportor de protoni de cianură de carbonil pentru a activa parkinul prin calea PINK1-Parkin.În comparație cu rezultatele noastre BRD4 PDPL, fuziunea N-terminală parkin a dezvăluit un set mai mare de proteine ​​țintă, deși a acoperit o porțiune mai mare a capătului C-terminal (177 din 210) (Figura 5a, b și Date suplimentare 4).rezultatul este în concordanță cu rapoartele conform cărora etichetele N-terminale pot activa în mod aberant Parkin44.În mod surprinzător, au existat doar 18 proteine ​​suprapuse în datele noastre cu rezultatele AP-MS publicate pentru Parkin43, probabil din cauza diferențelor dintre liniile celulare și fluxurile de lucru proteomice.În plus față de patru proteine ​​cunoscute (ARDM1, HSPA8, PSMD14 și PSMC3) identificate prin două metode (Fig. 5c)43.Pentru a valida în continuare rezultatele LC-MS/MS, tratamentul cu PDPL și Western blotting ulterioară au fost utilizate pentru a compara rezultatele testului de celule părinte HEK293T și linia parkin N-terminală stabilă.Țintele necunoscute anterior CDK2, DUT, CTBP1 și PSMC4 au fost testate cu un liant cunoscut, DNAJB1 (Fig. 5d).
Graficul vulcan al proteinelor care interacționează cu parkin în celule HEK293T cu miniSOG exprimat stabil fuzionat la capătul N- sau C-terminal al parkinului (n = 3 experimente biologice independente).Testul t Student cu două cozi a fost folosit pe parcelele vulcanilor.HEK293T a fost utilizat ca martor negativ. Proteinele modificate semnificativ sunt evidențiate cu roșu (p < 0,05 și diferență de intensitate ionică > de 2 ori). Proteinele modificate semnificativ sunt evidențiate cu roșu (p < 0,05 și diferență de intensitate ionică > de 2 ori). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интосни в интесон). Proteinele modificate semnificativ sunt evidențiate cu roșu (p < 0,05 și diferență de > 2 ori în intensitatea ionilor).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в исница в ионлной). Proteinele modificate semnificativ sunt evidențiate cu roșu (p < 0,05 și > diferență de 2 ori în puterea ionică).Proteinele înrudite importante pentru HEK293T-miniSOG, dar nu importante pentru HEK293T sunt prezentate în verde.b Diagrama Venn care arată proteinele care se suprapun între construcțiile N-terminale și C-terminale.Etichetele N-terminale pot activa în mod aberant parkinul și pot duce la proteine ​​mai recunoscute.c Diagrama Venn care arată proteinele suprapuse între PDPL și AP-MS.Interactorii cunoscuți sunt enumerați, inclusiv 4 din 18 proteine ​​care se suprapun și 11 din 159 proteine ​​identificate în mod specific în PDPL.d Țintele reprezentative identificate prin LC-MS/MS au fost verificate prin Western blot.e Ssu72 și SNW1 au fost identificate ca substraturi de parkin neînregistrate.Aceste plasmide proteice marcate cu FLAG au fost transfectate în HEK293T și HEK293T-Parkin-miniSOG urmate de tratament CCCP la diferite momente.Degradarea a fost mai pronunțată în linia de supraexpresie Parkin.f Folosind inhibitorul de proteazom MG132, s-a confirmat că procesul de degradare a Ssu72 și SNW1 este mediat de ubiquitinarea proteazomului.Aceste experimente au fost repetate independent de cel puțin două ori cu rezultate similare.Datele brute sunt furnizate sub formă de fișiere de date brute.
În special, proteinele identificate de PDPL trebuie să includă proteine ​​de legare a parkinei și substraturile acestora.Pentru a detecta substraturi de parkin neînregistrate, am selectat șapte proteine ​​identificate (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 și SNW1) și plasmide transfectate pentru a expune aceste gene la HEK293T normal și a exprima stabil HEK293T miniSOG-Parkin urmat de tratamentul CCCP.Nivelurile proteinelor Ssu72 și SNW1 au fost reduse semnificativ în linia stabilă miniSOG-Parkin (Fig. 5e).Tratamentul cu CCCP timp de 12 ore a dus la cea mai semnificativă degradare a ambelor substraturi.Pentru a investiga dacă degradarea Ssu72 și SNW1 este reglată de ubiquitinarea proteazomului, a fost adăugat inhibitorul de proteazom MG132 pentru a inhiba activitatea proteazomului și, de fapt, am constatat că procesul de degradare a acestora a fost inhibat (Fig. 5f).Țintele suplimentare non-substrat au fost confirmate ca interactori Parkin folosind Western blot (Figura suplimentară 10), care a arătat rezultate consistente cu LC-MS/MS.În concluzie, integrarea fluxului de lucru PDPL cu verificarea transfecției proteinei țintă permite identificarea substraturilor E3 ligazei neînregistrate.
Am dezvoltat o platformă comună de marcare a proximității care vă permite să identificați în spațiu și timp POI-uri care interacționează.Platforma se bazează pe proteina fotosensibilizantă miniSOG, care are doar aproximativ 12 kDa, mai puțin de jumătate din dimensiunea enzimei APEX2 mature (27 kDa) și o treime din dimensiunea TurboID (35 kDa).Dimensiunea mai mică ar trebui să extindă foarte mult gama de aplicații pentru studiul interatomilor mici de proteine.Explorarea suplimentară a fotosensibilizatorilor suplimentari, fie că sunt proteine ​​codificate genetic sau molecule mici, este necesară pentru a crește randamentul cuantic al oxigenului singlet și pentru a extinde sensibilitatea acestei abordări.Pentru versiunea actuală a miniSOG, se poate obține o rezoluție temporală ridicată folosind iluminarea albastră pentru a activa marcatorii de proximitate.În plus, timpul de expunere mai lung a eliberat un „nor” mai mare de oxigen singlet, ceea ce a dus la modificarea mai multor reziduuri distale de histidină, o rază de etichetare crescută și capacitatea de a ajusta rezoluția spațială PDPL.De asemenea, am testat șapte sonde chimice pentru a crește raportul semnal-fond și am explorat mecanismul molecular din spatele acestei abordări.Fluxul de lucru TOP-ABPP combinat cu căutarea deschisă imparțială a confirmat că modificările au avut loc numai în histidine și nu a fost observat niciun micromediu consistent pentru modificările crescute ale histidinei, cu excepția unei preferințe moderate pentru histidine în regiunea buclei.
PDPL a fost, de asemenea, utilizat pentru a caracteriza proteomii subcelulari cu specificitate și acoperire pentru proteom cel puțin comparabile cu alte metode de etichetare de proximitate și probe chimice specifice organelelor.Markerii de proximitate au fost, de asemenea, utilizați cu succes pentru a caracteriza proteoamele de suprafață, lizozomiale și secretom-associate46,47.Credem că PDPL va fi compatibil cu aceste organite subcelulare.În plus, am provocat PDPL prin identificarea țintelor pentru legarea proteinelor citosolice care sunt mai complexe decât proteinele legate de membrană datorită proprietăților lor dinamice și implicării în interacțiuni mai temporale.PDPL a fost aplicat la două proteine, coactivatorul transcripțional BRD4 și ligaza E3 Parkin asociată bolii.Aceste două proteine ​​au fost alese nu numai pentru funcțiile lor biologice fundamentale, ci și pentru relevanța lor clinică și potențialul terapeutic.Pentru aceste două puncte de interes, au fost identificați parteneri obligatorii bine cunoscuți, precum și ținte neînregistrate.În special, proteina SFPQ asociată separării fazelor a fost confirmată prin co-IP, ceea ce poate indica un nou mecanism prin care BRD4 (izoforma scurtă) reglează LLPS.În același timp, credem că identificarea substraturilor Parkin este un scenariu în care se impune identificarea adezivilor indirecti.Am identificat două substraturi de parkin neidentificate și am confirmat degradarea lor de-a lungul căii ubiquitinare-proteazom.Recent, a fost dezvoltată o strategie de captare bazată pe mecanism pentru a detecta substraturile hidrolazei prin captarea lor cu enzime.Deși aceasta este o metodă foarte puternică, nu este potrivită pentru analiza substraturilor implicate în formarea de complexe mari și necesită formarea de legături covalente între enzimă și substrat.Ne așteptăm ca PDPL să poată fi extins pentru a studia alte complexe de proteine ​​și familii de enzime, cum ar fi familiile deubiquitinaze și metaloproteaze.
O nouă formă de miniSOG, numită SOPP3, a fost dezvoltată cu producție îmbunătățită de oxigen singlet.Am comparat miniSOG cu SOPP3 și am constatat o performanță de marcare îmbunătățită, deși raportul semnal-zgomot a rămas neschimbat (Figura 11 suplimentară).Am emis ipoteza că optimizarea SOPP3 (de exemplu, prin evoluție direcționată) ar duce la proteine ​​fotosensibilizatoare mai eficiente, care necesită timpi de lumină mai scurti și astfel să permită capturarea proceselor celulare mai dinamice.În special, versiunea actuală a PDPL este limitată la mediul celular, deoarece necesită iluminare cu lumină albastră și nu poate pătrunde în țesuturile profunde.Această caracteristică exclude utilizarea sa în studiile pe modele animale.Cu toate acestea, combinația de optogenetică cu PDPL ar putea oferi o oportunitate pentru cercetarea pe animale, în special în creier.În plus, și alți fotosensibilizatori în infraroșu proiectați înlătură această limitare.Cercetările sunt în curs de desfășurare în acest domeniu.
Linia de celule HEK293T a fost obținută de la ATCC (CRL-3216).Linia celulară a fost testată negativă pentru infecția cu micoplasmă și a fost cultivată în DMEM (Thermo, #C11995500BT) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS, Vistech, #SE100-B) și 1% penicilină/streptomicina (Hyclone, #SV30010).crescut în.
3-Aminofenilen (proba 3) și (4-etinilfenil)metanamină (proba 4) au fost achiziționate de la Bidepharm.Propilamina (sonda 2) a fost achiziționată de la Energy-chemicals.N-(2-Aminofenil)pent-4-inamida (sonda 1) a fost sintetizată conform metodelor publicate.
Tabelul suplimentar 1 listează constructele genetice utilizate în acest studiu.Secvențele miniSOG și KillerRed au fost donate dintr-o plasmidă cadou de la P. Zou (Universitatea din Beijing).Secvența de țintire a matricei mitocondriale a fost derivată din cei 23 de aminoacizi N-terminali ai COX4 și donată în vectorii indicați folosind un ansamblu Gibson (Beyotime, #D7010S).Pentru a viza membrana și nucleul reticulului endoplasmatic, ADN uman SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) amplificat prin PCR dintr-o bibliotecă de ADNc de celule HEK293T și ADN H2B (donat de D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) și clonat, așa cum sa menționat mai sus.Dacă nu se indică altfel, alte gene proteice utilizate pentru transfecția și construcția liniilor celulare stabile au fost amplificate prin PCR din biblioteca de ADNc de celule HEK293T.G3S (GGGS) și G4S (GGGGS) au fost utilizate ca linkeri între proteina de momeală și miniSOG.O etichetă epitop V5 (GKPIPNPLLGLDST) a fost adăugată la aceste constructe de fuziune.Pentru exprimare la mamifere și pentru a stabili o linie celulară stabilă, constructul de fuziune miniSOG a fost subclonat în vectorul lentiviral pLX304.Pentru exprimarea bacteriană, miniSOG a fost donat în vectorul pET21a marcat 6xHis la capătul C-terminal.
Celulele HEK293T au fost însămânțate la 2,0 x 105 celule per godeu în plăci cu șase godeuri și transfectate 24 de ore mai târziu cu plasmide lentivirale recombinate (2,4 μg pLX304) și plasmide de ambalare virală (1,5 μg psPAX2 și 1,2 μg pMD2. , #C0533), aproximativ 80% fuziune.După transfecția peste noapte, mediul a fost schimbat și incubat pentru încă 24 de ore.Colectarea virusului a fost efectuată după 24, 48 și 72 de ore.Înainte de infectarea liniilor celulare țintă, mediul viral a fost filtrat printr-un filtru de 0,8 μm (Merck, #millex-GP) și s-a adăugat polibrenă (Solarbio, #H8761) la o concentrație de 8 μg/ml.După 24 de ore, celulele au fost lăsate să se recupereze prin schimbarea mediului.Celulele au fost selectate folosind 5 ug/ml blasticidină (Solarbio, #3513-03-9) pentru primele trei pasaje ca o selecție mai riguroasă.Apoi a folosit 20 μg/ml ca regim mai strict pentru următoarele trei pasaje.
Celulele au fost însămânțate în camere cu 12 godeuri (Ibidi, #81201) la o densitate de aproximativ 20.000 de celule per godeu.Pentru a îmbunătăți aderența celulelor HEK293T, adăugați 50 ug/ml fibronectină (Corning, #356008) diluată în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS, Sangon, #B640435) la 37°C.Camerele au fost pretratate timp de 1 oră și apoi îndepărtate cu PBS.După 24 de ore, celulele au fost spălate o dată cu PBS, incubate cu sonda 3 1 mM în soluție proaspătă de sare echilibrată a lui Hanks (HBSS, Gibco, #14025092) timp de 1 oră la 37°C și apoi incubate cu un LED albastru (460 nm). ).) au fost iradiate timp de 10 minute la temperatura camerei.După aceea, celulele au fost spălate de două ori cu PBS și fixate cu formaldehidă 4% în PBS (Sangon, #E672002) timp de 15 minute la temperatura camerei.Excesul de formaldehidă a fost îndepărtat din celulele fixate prin spălare de trei ori cu PBS.Celulele au fost apoi permeabilizate cu 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) în PBS și spălate de 3 ori cu PBS.Apoi îndepărtați camera și adăugați la fiecare probă 25 µl dintr-un amestec de reacție clic care conține 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) şi 0,5 mg/ml ascorbat de sodiu (Aladdin, nr. S105024) şi incubat timp de 30 minute la temperatura camerei.După o reacție rapidă, celulele au fost spălate de șase ori cu PBS care conține 0,05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) și apoi blocate cu 5% BSA (Abcone, #B24726) în PBST timp de 30 de minute la temperatura camerei.
Pentru imunocolorarea de colocalizare, celulele au fost incubate cu anticorpi primari în conformitate cu condițiile indicate: mAb anti-V5 de șoarece (1:500, CST, #80076), mAb anti-Hsp60 de iepure (1:1000), ABclonal, #A0564), anticorp policlonal anti-calnexină de iepure (1:500, Abcam, #ab22595) sau anticorp monoclonal anti-lamină A/C de iepure (1:500; CST, #2032) la 4°C peste noapte.După spălare de 3 ori cu PBST, celulele au fost incubate cu anticorpi secundari: capră anti-iepure Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diluat 1:1000, capră anti-șoarece Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diluat 1:1000.diluare Se diluează la temperatura camerei timp de 30 de minute.Celulele au fost apoi spălate de 3 ori cu PBST și contracolorate cu DAPI (Thermo, #D1306) în PBS timp de 10 minute la temperatura camerei.După 3 spălări cu PBS, celulele au fost sigilate în glicerol 50% (Sangon, #A600232) în PBS pentru imagistica.Imaginile imunofluorescente au fost obținute folosind un microscop confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 și software-ul ZNE 3.5.
Pentru imagistica fluorescentă cu oxigen singlet, celulele au fost spălate de două ori cu tampon HEPES Hanks înainte de a adăuga 100 nM Si-DMA în tampon Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).După expunerea la lumină, celulele au fost incubate într-un incubator cu CO2 la 37°C timp de 45 de minute.Celulele au fost apoi spălate de două ori cu tampon HEPES Hanks și contracolorate cu Hoechst în tampon HEPES Hanks timp de 10 minute la temperatura camerei și vizualizate folosind un microscop confocal ZEISS LSM 900., #M36008) în tampon HBSS care conține calciu și magneziu.După expunerea la lumină sau doxorubicină (MCE, #HY-15142A), celulele au fost incubate într-un incubator cu CO2 la 37°C timp de 10 minute, spălate de două ori cu tampon HBSS și incubate cu Hoechst în tampon HBSS la temperatura camerei.minute.Doxorubicina a fost utilizată ca un control pozitiv al sondei în care celulele au fost tratate cu 20 μM doxorubicină în HBSS care conține 1% BSA timp de 30 de minute.Imaginile imunofluorescente au fost obținute folosind un microscop confocal Zeiss LSM 900.
Celulele HEK293T care exprimă stabil mito-miniSOG au fost însămânțate la o densitate de aproximativ 30% în vase de 15 cm.După 48 de ore, când s-a atins o confluență de ~80%, celulele au fost spălate o dată cu PBS, incubate cu Sonda 3 1 mM în tampon HBSS proaspăt timp de 1 oră la 37°C și apoi iluminate cu un LED albastru timp de 10 minute în cameră. temperatura..După aceea, celulele au fost spălate de două ori cu PBS, răzuite și resuspendate în tampon PBS rece cu gheață care conține inhibitori de protează fără EDTA (MCE, #HY-K0011).Celulele au fost lizate prin sonicarea vârfului timp de 1 minut (1 secundă pornit și 1 secundă oprit la 35% amplitudine).Amestecul rezultat a fost centrifugat la 15.871 xg timp de 10 minute la 4°C pentru a îndepărta resturile, iar concentrația de supernatant a fost ajustată la 4 mg/mL utilizând un kit de analiză a proteinei BCA (Beyotime, #P0009).Combinați 1 ml din lizatul de mai sus cu azidă de biotină fotodegradabilă 0,1 mM (Confluore, #BBBD-14), TCEP 1 mM (Sangon, #A600974), ligand TBTA 0,1 mM (Aladdin, #T162437) și incubator CuSO4 1 mM cu fund rotire timp de 1 oră la temperatura camerei.După o reacție rapidă, adăugați amestecul la soluția preamestecată (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) într-un flacon de sticlă de 10 ml.Probele au fost amestecate și centrifugate la 4500 g timp de 10 minute la temperatura camerei.Soluțiile inferioare și superioare au fost aruncate, precipitatul a fost spălat de două ori cu 1 ml de metanol și centrifugat la 15871 x g timp de 5 minute la 4°C.Se adaugă 1 ml de uree 8 M (Aladdin, nr. U111902) în bicarbonat de amoniu 25 mM (ABC, Aladdin, nr. A110539) pentru a dizolva precipitatul.Probele au fost reconstituite cu 10 mM ditiotreitol (Sangon, #A100281 în 25 mM ABC) timp de 40 de minute la 55°C urmată de adăugarea a 15 mM iodoacetamidă proaspătă (Sangon, #A600539) la temperatura camerei în întuneric.Alchilare în 30 de minute..S-a adăugat suplimentar 5 mM ditiotreitol pentru a opri reacţia.Se prepară aproximativ 100 µl de perle de agaroză NeutrAvidin (Thermo, #29202) pentru fiecare probă prin spălare de 3 ori cu 1 ml PBS.Soluția de proteom de mai sus a fost diluată cu 5 ml PBS și incubată cu perle de agaroză NeutrAvidin pre-spălate timp de 4 ore la temperatura camerei.Granulele au fost apoi spălate de 3 ori cu 5 ml PBS conţinând 0,2% SDS (Sangon, #A600485), de 3 ori cu 5 ml PBS conţinând 1 M uree şi de 3 ori cu 5 ml ddH2O.Granulele au fost apoi recoltate prin centrifugare și resuspendate în 200 μl de 25 mM ABC care conține 1 M uree, 1 mM CaCl2 (Macklin, # C805228) și 20 ng/μl tripsină (Promega, # V5280).Se tripsinizează peste noapte la 37°C cu rotație.Reacția a fost oprită prin adăugarea de acid formic (Thermo, # A117-50) până când pH-ul a atins 2-3.Granulele au fost spălate de 3 ori cu 1 ml de PBS care conține 0,2% SDS, de 3 ori cu 1 ml de PBS care conține 1 M uree și apoi de 3 ori cu 1 ml de apă distilată.Peptidele modificate au fost eliberate prin liză luminoasă (365 nm) timp de 90 de minute utilizând 200 μl de MeOH 70%.După centrifugare, supernatantul a fost colectat.Granulele au fost apoi spălate o dată cu 100 μl de 70% MeOH și supernatanții au fost reuniți.Probele au fost uscate într-un concentrator în vid Speedvac și păstrate la -20°C până la analiză.
Pentru a identifica și cuantifica peptidele modificate cu oxigen singlet, probele au fost redizolvate în acid formic 0,1% și 1 μg de peptide au fost analizate utilizând un spectrometru de masă Orbitrap Fusion Lumos Tribrid echipat cu o sursă nano ESI de la Tune și Xcalibur de la software-ul furnizorului 4.3.Probele au fost separate pe o coloană capilară ambalată intern de 75 µm × 15 cm cu material C18 de 3 µm (ReproSil-pur, #r13.b9.) și conectate la un sistem UHPLC EASY-nLC 1200 (Thermo).Peptidele au fost separate prin cromatografie liniară cu gradient de 95 de minute de la 8% solvent B la 50% solvent B (A = 0,1% acid formic în apă, B = 0,1% acid formic în 80% acetonitril), apoi crescut liniar la 98% B min. în 6 min la un debit de 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos colectează date alternativ între scanarea completă MS și scanarea MS2, în funcție de date.Tensiunea de pulverizare a fost setată la 2,1 kV și temperatura capilarului de transport ionic a fost de 320°C.Spectrele MS (350-2000 m/z) au fost colectate cu o rezoluție de 120.000, AGC 4 × 105 și un timp maxim de intrare de 150 ms.Cei 10 cei mai obișnuiți precursori cu încărcare multiplă din fiecare scanare completă au fost fragmentați folosind HCD cu o energie de coliziune normalizată de 30%, o fereastră de izolare a cvadrupolului de 1,6 m/z și o setare de rezoluție de 30.000.O țintă AGC pentru spectrometrie de masă în tandem folosind 5×104 și timp maxim de intrare 150 ms.Excepția dinamică este setată la 30 de secunde. Ionii nealocați sau cei cu o sarcină de 1+ și >7+ au fost respinși pentru MS/MS. Ionii nealocați sau cei cu o sarcină de 1+ și >7+ au fost respinși pentru MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ionii nealocați sau ionii cu o sarcină de 1+ și >7+ au fost respinși pentru MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ionii nespecificați sau ionii cu sarcini de 1+ și >7+ au fost respinși pentru MS/MS.
Datele brute sunt procesate folosind platforma de calcul FragPipe bazată pe MSFragger.Prejudecățile de masă și aminoacizii corespunzători au fost determinate folosind un algoritm de căutare deschisă cu o toleranță la masa precursorului de -150 până la 500 Da.Peptidele modificate au fost apoi identificate folosind modificări de histidină cu câștiguri de masă de +229,0964 și +247,1069 Da în PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Celulele care exprimă stabil gena miniSOG fuzionată au fost placate în vase de 6 cm.La atingerea confluenței ~80%, celulele au fost spălate o dată cu HBSS (Gibco, #14025092), apoi incubate cu sonde chimice în HBSS timp de 1 oră la 37°C și iluminate cu lumină albastră.LED 10W timp de 20 de minute la temperatura camerei.Pentru a determina ce tip de specie reactivă de oxigen este implicată în PDPL, 0,5 mM vitamina C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM manitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 uM H2O2, 10 mM NaN3 au fost adăugate la celule ca suplimente.După spălare cu PBS rece, celulele au fost răzuite, colectate în tuburi de centrifugă de 1,5 ml și sonicate cu un vârf timp de 1 min în 200 μl de PBS cu 1x inhibitor de protează fără EDTA (1 s și 1 s fără, amplitudine 35%).Amestecul rezultat a fost centrifugat la 15.871 × g timp de 10 minute la 4 ° C și concentrația supernatantului a fost ajustată la 1 mg/mL folosind un kit de analiză a proteinei BCA.Aproximativ 50 ui din lizatul de mai sus au fost incubați cu 0,1 mM azidă de rodamină (Aladdin, nr. T131368), 1 mM TCEP, 0,1 mM ligand TBTA și 1 mM CuS04 timp de 1 oră la temperatura camerei cu rotație de jos în sus.După reacția de clic, precipitarea cu acetonă a fost efectuată prin adăugarea a 250 μl de acetonă pre-răcită la probe, incubarea la -20°C timp de 20 de minute și centrifugarea la 6010 x g timp de 10 minute la 4°C.Se colectează peleta și se fierbe în 50 µl de tampon Laemmli 1x timp de 10 minute la 95 °C.Probele au fost apoi analizate pe geluri lungi SDS-PAGE și vizualizate folosind sistemul de imagistică Bio-rad ChemiDoc MP Touch cu software-ul Image Lab Touch.
Exprimarea și purificarea proteinei recombinate miniSOG-6xHis au fost efectuate așa cum s-a descris anterior.Pe scurt, celulele E. coli BL21(DE3) (TransGen, #CD701-02) au fost transformate cu pET21a-miniSOG-6xHis și expresia proteinei a fost indusă cu 0,5 mM IPTG (Sangon, #A600168).După liza celulară, proteinele au fost purificate folosind perle de agaroză Ni-NTA (MCE, nr. 70666), dializate împotriva PBS și stocate la -80°C.
Pentru un test de proximitate a etichetei in vitro pe bază de anticorpi, amestecați 100 μM miniSOG purificat, 1 mM sonda 3 și 1 μg anticorp monoclonal de șoarece anti-etichetă (TransGen, #HT501-01) în PBS la un volum total de reacție de 50 μl..Amestecul de reacție a fost iradiat cu lumină LED albastră timp de 0, 2, 5, 10 și 20 de minute la temperatura camerei.Amestecul a fost incubat cu 0,1 mM biotină-PEG3-azid (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0,1 mM ligand TBTA și 1 mM CuS04 timp de 1 oră la temperatura camerei pe un agitator cu mișcare ascendentă.După o reacție rapidă, adăugați 4x tampon Laemmli direct în amestec și fierbeți la 95°C timp de 10 minute.Probele au fost analizate pe geluri SDS-PAGE și analizate prin western blot cu streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
O peptidă sintetică care conține histidină cu amidare C-terminală (LHDALDAK-CONH2) a fost utilizată pentru a analiza marcarea in vitro pe bază de peptidă din apropiere.În acest test, 100 μM miniSOG purificat, 10 mM sonda 3 și 2 μg/ml peptidă sintetică au fost amestecate în PBS într-un volum total de reacție de 50 μl.Amestecul de reacţie a fost iradiat cu lumină LED albastră timp de 1 oră la temperatura camerei.Un microlitru de probă a fost analizat utilizând un sistem LC-MS (Waters, spectrometru de masă SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight cu software-ul de analiză a spectrului MassLynx).
Celulele HEK293T care exprimă stabil gena de fuziune miniSOG au fost însămânțate în plăci de 10 cm pentru linii cu localizare diferită de organele (Mito, ER, Nucleus) și plăci de 15 cm pentru liniile Parkin-miniSOG și BRD4-miniSOG.La atingerea confluenței ~90%, celulele au fost spălate o dată cu HBSS, apoi incubate cu sonda 3 în HBSS timp de 1 oră la 37°C și iluminate cu un LED albastru de 10 W la temperatura camerei.Pentru marcarea fără contact a Parkinului, 10 pM proton carbonil cianură purtător m-clorofenilhidrazonă CCCP (Solarbio, #C6700) cu sonda 3 în HBSS a fost adăugat timp de 1 oră la 37°C.Etapele de liză celulară, chimie de clic, reducere și alchilare au fost aceleași ca cele descrise mai sus, cu excepția faptului că s-au adăugat 2 mg de lizat și azida de biotină PEG3 a fost utilizată în reacția de clic în loc de azida de biotină fotodegradabilă.După îmbogățire, bilele au fost spălate de 3 ori cu 5 ml de PBS care conține 0,2% SDS, de 3 ori cu 5 ml de PBS care conține 1 M uree și de 3 ori cu 5 ml de PBS.După aceea, s-au adăugat 2 ug tripsină la 300 ui 25 mM ABC conţinând 1 M uree pentru a scinda proteina peste noapte la 37°C.Reacția a fost oprită prin adăugarea de acid formic până când s-a atins un pH de 2-3.După tripsinizare pe granule, soluţia de peptide a fost desalină utilizând o coloană SOLAp HRP (Thermo, #60209-001) şi uscată într-un concentrator de vid Speedvac.Peptidele au fost redizolvate în acid formic 0,1% și 500 ng de peptide au fost analizate utilizând un spectrometru de masă Orbitrap Fusion Lumos Tribrid echipat cu sursa nano-ESI descrisă mai sus.Peptidele au fost separate pe precoloane comerciale RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, nr. 164946) și coloane analitice RP-HPLC (75 μm x 25 cm) (Thermo, nr. 164941), ambele umplute cu 2 μm.gradient de la 8% la 35% ACN în 60 de minute, apoi crescut liniar la 98% B în 6 minute la un debit de 300 Nl/min.Spectrele MS (350-1500 m/z) au fost colectate cu o rezoluție de 60.000, AGC 4 × 105 și un timp maxim de intrare de 50 ms.Ionii selectați au fost fragmentați secvențial de HCD în cicluri de 3 s cu o energie de coliziune normalizată de 30%, o fereastră de izolare a cvadrupolului de 1,6 m/z și o rezoluție de 15000. Un spectrometru de masă tandem 5 × 104 țintă AGC și un timp maxim de injectare de 22 ms au fost folosite.Excluderea dinamică este setată la 45 de secunde. Ionii nealocați sau cei cu o sarcină de 1+ și >7+ au fost respinși pentru MS/MS. Ionii nealocați sau cei cu o sarcină de 1+ și >7+ au fost respinși pentru MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ionii nealocați sau ionii cu o sarcină de 1+ și >7+ au fost respinși pentru MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ionii nespecificați sau ionii cu sarcini de 1+ și >7+ au fost respinși pentru MS/MS.
Etapele de pregătire a probei până la îmbogățirea perlelor de NeutrAvidin au fost aceleași ca în analiza LC-MS/MS descrisă mai sus.Aproximativ 50 μg de lizat au fost utilizate ca intrare pentru controlul încărcării și 2 mg de lizat au fost utilizate pentru reacțiile de clic.După îmbogățire și spălare cu neutravidină, proteinele legate au fost eluate prin adăugarea a 50 μl de tampon Laemmli la bilele de rășină de agaroză și fierbere la 95°C timp de 5 minute.Intrarea de control al încărcăturii și probele îmbogățite cu perle au fost analizate prin SDS-PAGE și transferate pe membrane PVDF (Millipore, #ISEQ00010) prin metode Western blot standard.Membranele au fost blocate cu lapte degresat 5% (Sangon, #A600669) în TBS conţinând 0,1% tween-20 (TBST) şi incubate secvenţial cu anticorpi primari şi secundari.Anticorpii primari au fost diluați 1:1000 în lapte degresat 5% în TBST și incubați peste noapte la 4°C.Anticorpii secundari au fost utilizați într-un raport de 1:5000 și incubați timp de 1 oră la temperatura camerei.Membranele au fost vizualizate prin chemiluminiscență folosind sistemul de imagistică Chemidoc MP.Toate scanările netăiate ale petelor și gelurilor din figură sunt prezentate ca date brute.
Anticorpii primari utilizați în acest studiu au inclus anticorp monoclonal de iepure anti-SFPQ (CST, nr. 71992), anticorp monoclonal de iepure anti-FUS (CST, nr. 67840), anticorp policlonal de iepure anti-NSUN2 (Proteintech, nr. 20854-1-). AP), anticorp policlonal de iepure anti-mSin3A (Abcam, #ab3479), anticorp monoclonal anti-etichetă de șoarece (TransGen, #HT201-02), anticorp monoclonal anti-β-actină de șoarece (TransGen, #HC201-01), anti de iepure -anticorp monoclonal CDK2 (ABclonal, #A0094), anticorp monoclonal de iepure la CTBP1 (ABclonal, #A11600), anticorp policlonal de iepure împotriva DUT (ABclonal, #A2901), anticorp policlonal de iepure împotriva PSMC4 (ABclonal, #A2505), anti- iepure Anticorp policlonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Acești anticorpi au fost utilizați la o diluție de 1:1000 în lapte degresat 5% în TBST.Anticorpii secundari utilizați în acest studiu au inclus IgG anti-iepure (TransGen, #HS101-01), IgG anti-șoarece (TransGen, #HS201-01) la o diluție de 1:5000.
Pentru a investiga în continuare dacă BRD4 interacționează cu SFPQ, celulele HEK293T și BRD4-miniSOG stabile care supraexprimă HEK293T au fost placate în vase de 10 cm.Celulele au fost spălate cu PBS rece și lizate în 1 ml tampon de liză Pierce IP (Thermo Fisher, #87787) cu inhibitor de protează fără EDTA timp de 30 de minute la 4°C.După aceea, lizatele au fost colectate în tuburi de centrifugă de 1,5 ml și centrifugate la 15.871 xg timp de 10 minute la 4°C.Supernatantul a fost recoltat și incubat cu 5 pg de anticorp monoclonal de șoarece marcat cu anti-V5 (CST, #80076) peste noapte la 4°C.Spălați aproximativ 50 µl de perle magnetice de proteină A/G (MCE, #HY-K0202) de două ori cu PBS care conține 0,5% Tween-20.Apoi, lizatele celulare au fost incubate cu perle magnetice timp de 4 ore la 4°C cu rotație de jos în sus.Apoi granulele au fost spălate de patru ori cu 1 ml de tampon PBST și fierte la 95°C timp de 5 minute.Probele au fost analizate pe geluri SDS-PAGE și transferate pe membrane PVDF folosind metode Western blot standard.Membranele au fost blocate în lapte degresat 5% în TBST și incubate secvenţial cu anticorpi primari și secundari.Anticorp primar Anticorp monoclonal anti-SFPQ de iepure (CST, #71992) a fost utilizat într-un raport de 1:1000 în lapte degresat 5% în TBST și incubat peste noapte la 4°C.IgG anti-iepure a fost utilizată într-un raport de 1:5000 și incubată timp de 1 oră la temperatura camerei.Membranele au fost vizualizate prin chemiluminiscență folosind sistemul de imagistică Chemidoc MP.
Toate structurile utilizate pentru analiza zonei de suprafață accesibilă cu solvent (SASA) au fost obținute din Protein Data Bank (PDB)52 sau AlphaFold Protein Structure Database53.SASA absolută a fost calculată pentru fiecare reziduu utilizând programul FreeSASA.Doar datele SASA complete și neechivoce pentru histidina marcată și vecinii săi au fost utilizate pentru a obține SASA medie pentru fiecare structură.Accesibilitatea relativă la solvent (RSA) pentru fiecare histidină a fost calculată prin împărțirea valorii SASA absolută la suprafața maximă empirică posibilă a reziduului disponibilă pentru solvent.Toate histidinele au fost apoi clasificate ca ascunse dacă RSA medie era sub 20%, altfel expuse56.
Fișierele brute obținute în modul DDA au fost căutate folosind Proteome Discoverer (v2.5) sau MSfragger (Fragpipe v15.0) în baza de date corespunzătoare de proteine ​​​​verificate SwissProt care conține contaminanți obișnuiți.Peptidele au necesitat tripsină completă cu două situsuri de clivaj lipsă, metilarea carbamoilului ca modificare fixă ​​și oxidarea metioninei ca modificare dinamică.Toleranța de greutate a precursorului și a fragmentului au fost stabilite la 10 ppm și, respectiv, 0,02 Da (MS2 Orbitrap). Loviturile contaminanților au fost îndepărtate, iar proteinele au fost filtrate pentru a obține o rată de descoperire falsă de <1%. Loviturile contaminanților au fost îndepărtate, iar proteinele au fost filtrate pentru a obține o rată de descoperire falsă de <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы полуфи полуфи чо%. Loviturile contaminanților au fost îndepărtate și proteinele au fost filtrate pentru a da o rată de detecție falsă de <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены 1%. Loviturile contaminanților au fost îndepărtate și proteinele au fost filtrate pentru a obține o rată fals pozitivă de <1%.Pentru analiza cantitativă fără utilizarea etichetelor, a fost utilizat conținutul de proteine ​​​​normalizate din trei repetări biologice.Analiza localizării subcelulare a proteinelor a fost efectuată utilizând analiza Gene Ontology (GO) de la DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 și baze de date compilate și publicate de grupul Alice Ting.Harta vulcanilor a fost obținută de la Perseus (v1.6.15.0). Modificările în plierea abundenței proteinelor au fost testate pentru semnificația statistică utilizând un test t cu două fețe, iar loviturile de proteine ​​au fost identificate cu modificarea abundenței > 2 (dacă nu se specifică altfel) și valoarea p <0,05. Modificările în plierea abundenței proteinelor au fost testate pentru semnificația statistică utilizând un test t cu două fețe, iar loviturile de proteine ​​au fost identificate cu modificarea abundenței > 2 (dacă nu se specifică altfel) și valoarea p <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Modificările de ori a conținutului de proteine ​​au fost testate pentru semnificația statistică folosind un test t cu două cozi, iar potrivirile de proteine ​​au fost identificate cu modificarea conținutului > 2 (dacă nu este menționat altfel) și valoarea ap <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化 变化 2 （除非 另 有 说明 和 和 P 值 <0,05。使用 双边 T 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 显着性 并 蛋白质 命 中 的 丰度 变化 变化> 2 （另 有 说明 和 和 P 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Semnificația statistică a modificărilor de ori în conținutul de proteine ​​a fost testată folosind un test t cu două cozi, iar potrivirile proteinelor au fost determinate pentru modificări de conținut > 2 (dacă nu se indică altfel) și valorile p <0,05.Analiza interacțiunii proteinelor a fost efectuată folosind analiza GO împreună cu baza de date String.
Au fost efectuate trei replici biologice cu rezultate similare.Analiza statistică a fost făcută cu GraphPad Prism (software-ul GraphPad) și au fost generate diagrame de vulcan cu Perseus (v1.6.15.0).Pentru a compara cele două grupuri, valorile p au fost determinate folosind un test t Student cu două cozi.Doar proteinele singleton identificate de cel puțin două ori în grupul experimental au fost incluse în diagramele vulcanilor, iar valorile corespunzătoare lipsă din grupul de control au fost înlocuite cu Perseus dintr-o distribuție normală, astfel încât valoarea p să poată fi calculată.Barele de eroare reprezintă media ± abaterea standard.În analizele proteomice pentru analize statistice, abundența proteinelor care au apărut în cel puțin două replici biologice a fost reținută.Metodele statistice nu au fost utilizate pentru a predetermina dimensiunea eșantionului.Experimentele nu sunt întâmplătoare.Cercetătorii nu au fost orbi la sarcini în timpul experimentului și evaluării rezultatelor.
Pentru mai multe informații despre proiectarea studiului, consultați rezumatul Raportului de cercetare în natură legat de acest articol.
Datele de spectrometrie de masă obținute în acest studiu au fost transmise Consorțiului ProteomeXchange prin intermediul depozitului partenerului iProX57 sub ID-ul setului de date PXD034811 (set de date PDPL-MS).Datele brute sunt furnizate sub formă de fișiere de date brute.Acest articol oferă datele originale.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Cunoașterea vecinătății: utilizarea biotinilației dependente de proximitate pentru a caracteriza complexele proteice și hărți organele. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Cunoașterea vecinătății: utilizarea biotinilației dependente de proximitate pentru a caracteriza complexele proteice și hărți organele.Gingras, AS, Abe, KT și Raut, B. Familiaritate cu mediul înconjurător: folosind biotinilarea dependentă de proximitate pentru a caracteriza complexele proteice și hărți organele. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘合物并绘绘剩并绘 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Înțelegerea cartierului: folosiți dependența cartierului de viața biologică.Gingras, AS, Abe, KT și Raut, B. Înțelegerea proximității: caracterizarea complexelor proteice și maparea organitelor folosind biotinilarea dependentă de proximitate.Actual.Opinia mea.Chimic.biologie 48, 44–54 (2019).
Geri, JB şi colab.Cartografierea micromediului prin transferul energiei Dexter către celulele imune.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL şi colab.Rețelele la scară cu doi proteom detectează remodelarea specifică celulei a interatomului uman.Celulele 184, 3022–3040.e3028 (2021).