Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Fotosensibilizatorii eficienți sunt deosebit de importanți pentru utilizarea clinică pe scară largă a fototerapiei.Cu toate acestea, fotosensibilizatorii convenționali suferă în general de absorbție cu lungime de undă scurtă, fotostabilitate insuficientă, randament cuantic scăzut al speciilor reactive de oxigen (ROS) și stingerea ROS indusă de agregare.Aici raportăm un fotosensibilizator supramolecular (RuDA) în infraroșu apropiat (NIR) mediat de auto-asamblarea complexelor organometalice Ru(II)-arenă în soluție apoasă.RuDA poate genera oxigen singlet (1O2) numai în stare agregată și prezintă un comportament evident de generare de 1O2 indus de agregare datorită unei creșteri semnificative a procesului de încrucișare între sistemul singlet-triplet.Sub acțiunea luminii laser de 808 nm, RuDA prezintă un randament cuantic de 1O2 de 16,4% (verde de indocianină aprobat de FDA: ΦΔ=0,2%) și o eficiență ridicată de conversie fototermală de 24,2% (nanoroduri de aur comerciale) cu o fotostabilitate excelentă.: 21,0%, nanoshell de aur: 13,0%).În plus, RuDA-NP-urile cu biocompatibilitate bună se pot acumula de preferință la locurile tumorii, provocând o regresie semnificativă a tumorii în timpul terapiei fotodinamice cu o reducere de 95,2% a volumului tumorii in vivo.Această terapie fotodinamică care sporește agregarea oferă o strategie pentru dezvoltarea fotosensibilizatorilor cu proprietăți fotofizice și fotochimice favorabile.
În comparație cu terapia convențională, terapia fotodinamică (PDT) este un tratament atractiv pentru cancer datorită avantajelor sale semnificative, cum ar fi controlul spațio-temporal precis, non-invazivitatea, rezistența neglijabilă la medicamente și minimizarea efectelor secundare 1,2,3.Sub iradiere cu lumină, fotosensibilizatorii utilizați pot fi activați pentru a forma specii de oxigen foarte reactive (ROS), ducând la apoptoză/necroză sau răspunsuri imune4,5. Cu toate acestea, majoritatea fotosensibilizatorilor convenționali, cum ar fi clorurile, porfirinele și antrachinonele, au o absorbție cu lungime de undă relativ scurtă (frecvență < 680 nm), rezultând astfel o pătrundere slabă a luminii din cauza absorbției intense a moleculelor biologice (de exemplu, hemoglobina și melanina) în regiunea vizibilă6,7. Cu toate acestea, majoritatea fotosensibilizatorilor convenționali, cum ar fi clorurile, porfirinele și antrachinonele, au o absorbție cu lungime de undă relativ scurtă (frecvență < 680 nm), rezultând astfel o pătrundere slabă a luminii din cauza absorbției intense a moleculelor biologice (de exemplu, hemoglobina și melanina) în regiunea vizibilă6,7. Однако большинство обычных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, обладают относительно коротковолновым поглощением (частота < 680 нм), что приводит к плохому проникновению света из-за интенсивного поглощения биологических молекул (например, гемоглобина и меланина) в видимая область6,7. Cu toate acestea, cei mai obișnuiți fotosensibilizatori, cum ar fi clorurile, porfirinele și antrachinonele, au o absorbție cu lungime de undă relativ scurtă (< 680 nm), ceea ce duce la o penetrare slabă a luminii din cauza absorbției intense a moleculelor biologice (de exemplu, hemoglobină și melanină) în regiunea vizibilă6,7.然而，大多数传统的光敏剂，如二氢卟酚、卟啉和蒽醌，具有相对较短的波长吸收（频率< 680 nm），因此由于对生物分子（如血红蛋白和黑色素）的强烈吸收，导致光穿透性差。氢 卟酚 卟酚 、 卟啉 ， 具有 相对 较 短 的 波长 吸收 （频率 频率 频率 频率 频率 黑色素 黑色素 黑色素）） 的 因此 对 分子 分子 （血红 血红 和）） 的 ， ， ， ， 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 ， ， 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 ”吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 吸收 HI导致光穿透性差。 Однако большинство традиционных фотосенсибилизаторов, таких как хлорины, порфирины и антрахиноны, имеют относительно коротковолновое поглощение (частота < 680 нм) из-за сильного поглощения биомолекул, таких как гемоглобин и меланин, что приводит к плохому проникновению света. Cu toate acestea, majoritatea fotosensibilizatorilor tradiționali, cum ar fi clorurile, porfirinele și antrachinonele, au o absorbție cu lungime de undă relativ scurtă (frecvență < 680 nm) datorită absorbției puternice a biomoleculelor precum hemoglobina și melanina, ceea ce duce la o penetrare slabă a luminii.Zona vizibilă 6.7.Prin urmare, fotosensibilizatorii care absorb infraroșu apropiat (NIR) care sunt activați în „fereastra terapeutică” de 700-900 nm sunt potriviti pentru fototerapie.Deoarece lumina infraroșie apropiată este cea mai puțin absorbită de țesuturile biologice, poate duce la o penetrare mai profundă și la mai puține daune foto8,9.
Din păcate, fotosensibilizatorii care absorb NIR existenți au, în general, o fotostabilitate slabă, o capacitate scăzută de generare a oxigenului singlet (1O2) și stingerea 1O2 indusă de agregare, ceea ce limitează aplicarea lor clinică10,11.Deși s-au făcut eforturi mari pentru a îmbunătăți proprietățile fotofizice și fotochimice ale fotosensibilizatorilor convenționali, până acum mai multe rapoarte au raportat că fotosensibilizatorii care absorb NIR pot rezolva toate aceste probleme.În plus, mai mulți fotosensibilizatori s-au arătat promițători pentru generarea eficientă de 1O212,13,14 atunci când sunt iradiați cu lumină de peste 800 nm, deoarece energia fotonului scade rapid în regiunea aproape IR.Trifenilamină (TFA) ca donor de electroni și [1,2,5]tiadiazol-[3,4-i]dipirido[a,c]fenazină (TDP) ca grup acceptor de electroni Tipul Donor-acceptor (DA) colorează o clasă de coloranți, care absorb infraroșu apropiat, care au fost studiati pe larg pentru bioimaging II în infraroșu apropiat și terapia fototermală (PTT) datorită benzii interzise înguste.Astfel, coloranții de tip DA pot fi utilizați pentru PDT cu excitație aproape IR, deși au fost rar studiati ca fotosensibilizatori pentru PDT.
Este bine cunoscut faptul că eficiența ridicată a încrucișării intersistemului (ISC) a fotosensibilizatorilor favorizează formarea de 1O2.O strategie comună pentru avansarea procesului ISC este de a îmbunătăți cuplarea spin-orbită (SOC) a fotosensibilizatorilor prin introducerea de atomi grei sau fragmente organice speciale.Cu toate acestea, această abordare are încă unele dezavantaje și limitări19,20.Recent, auto-asamblarea supramoleculară a oferit o abordare inteligentă de jos în sus pentru fabricarea materialelor funcționale la nivel molecular,21,22 cu numeroase avantaje în fototerapie: (1) fotosensibilizatorii auto-asamblați pot avea potențialul de a forma structuri de panglică.Similar structurilor electronice cu o distribuție mai densă a nivelurilor de energie din cauza suprapunerii orbitelor dintre blocurile de construcție.Prin urmare, potrivirea energetică între starea excitată singlet inferioară (S1) și starea excitată triplet vecină (Tn) va fi îmbunătățită, ceea ce este benefic pentru procesul ISC 23, 24.(2) Ansamblul supramolecular va reduce relaxarea non-radiativă bazată pe mecanismul de limitare a mișcării intramoleculare (RIM), care promovează și procesul ISC 25, 26 .(3) Ansamblul supramolecular poate proteja moleculele interioare ale monomerului de oxidare și degradare, îmbunătățind astfel foarte mult fotostabilitatea fotosensibilizatorului.Având în vedere avantajele de mai sus, credem că sistemele de fotosensibilizare supramoleculară pot fi o alternativă promițătoare pentru a depăși deficiențele PDT.
Complexele pe bază de Ru(II) sunt o platformă medicală promițătoare pentru potențiale aplicații în diagnosticarea și terapia bolilor datorită proprietăților lor biologice unice și atractive28,29,30,31,32,33,34.În plus, abundența stărilor excitate și proprietățile fotofizico-chimice reglabile ale complexelor pe bază de Ru(II) oferă mari avantaje pentru dezvoltarea fotosensibilizatorilor pe bază de Ru(II)35,36,37,38,39,40.Un exemplu notabil este complexul polipiridil ruteniu(II) TLD-1433, care se află în prezent în studii clinice de fază II ca fotosensibilizant pentru tratamentul cancerului vezicii urinare non-invazive musculare (NMIBC)41.În plus, complexele organometalice de ruteniu(II)arene sunt utilizate pe scară largă ca agenți chimioterapeutici pentru tratamentul cancerului datorită toxicității lor scăzute și ușurinței de modificare42,43,44,45.Proprietățile ionice ale complexelor organometalice Ru(II)-arene pot nu numai să îmbunătățească solubilitatea slabă a cromoforilor DA în solvenți obișnuiți, ci și să îmbunătățească asamblarea cromoforilor DA.În plus, structura semi-sandwich pseudooctaedrică a complexelor organometalice de Ru(II)-arene poate preveni steric agregarea H a cromoforilor de tip DA, facilitând astfel formarea agregării J cu benzi de absorbție deplasate în roșu.Cu toate acestea, dezavantajele inerente ale complexelor Ru(II)-arenă, cum ar fi stabilitatea scăzută și/sau biodisponibilitatea slabă, pot afecta eficacitatea terapeutică și activitatea in vivo a complexelor arenă-Ru(II).Cu toate acestea, studiile au arătat că aceste dezavantaje pot fi depășite prin încapsularea complecșilor de ruteniu cu polimeri biocompatibili prin încapsulare fizică sau conjugare covalentă.
În această lucrare, raportăm complexe de Ru (II)-arenă (RuDA) conjugate cu DA cu un declanșator NIR printr-o legătură de coordonare între cromoforul DAD și fragmentul Ru (II)-arenă.Complexele rezultate se pot autoasambla în vezicule metalosupramoleculare în apă datorită interacțiunilor necovalente.În special, ansamblul supramolecular a dotat RuDA cu proprietăți de încrucișare intersistem induse de polimerizare, care au crescut semnificativ eficiența ISC, ceea ce a fost foarte favorabil pentru PDT (Fig. 1A).Pentru a crește acumularea tumorii și biocompatibilitatea in vivo, Pluronic F127 (PEO-PPO-PEO) aprobat de FDA a fost utilizat pentru a încapsula RuDA47,48,49 pentru a crea nanoparticule RuDA-NP (Figura 1B) care a acționat ca un PDT / Dual- foarte eficient. mod proxy PTT.În fototerapia cancerului (Figura 1C), RuDA-NP a fost utilizat pentru a trata șoarecii nuzi cu tumori MDA-MB-231 pentru a studia eficacitatea PDT și PTT in vivo.
Ilustrarea schematică a mecanismului fotofizic al RuDA în forme monomerice și agregate pentru fototerapia cancerului, sinteza B RuDA-NP și C RuDA-NP pentru PDT și PTT activate de NIR.
RuDA, constând din funcționalitatea TPA și TDP, a fost preparată conform procedurii prezentate în Figura suplimentară 1 (Figura 2A), iar RuDA a fost caracterizată prin spectre RMN 1H și 13C, spectrometrie de masă cu ionizare prin electrospray și analiză elementară (Figurile suplimentare 2-4 ).Harta diferențelor de densitate electronică RuDA a celei mai joase tranziții singlet a fost calculată prin teoria funcțională a densității dependente de timp (TD-DFT) pentru a studia procesul de transfer de sarcină.După cum se arată în figura suplimentară 5, densitatea de electroni se deplasează în principal de la trifenilamină la unitatea acceptor TDP după fotoexcitare, care poate fi atribuită unei tranziții tipice de transfer de sarcină intramoleculară (CT).
Structura chimică a minereului B Spectrele de absorbție a minereului în amestecuri de diferite rapoarte de DMF și apă.C Valori normalizate de absorbție ale RuDA (800 nm) și ICG (779 nm) în funcție de timp la 0,5 W cm-2 de lumină laser de 808 nm.D Fotodegradarea ABDA este indicată de formarea indusă de RuDA a 1O2 în amestecuri DMF/H2O cu diferite conținuturi de apă sub acțiunea radiației laser cu o lungime de undă de 808 nm și o putere de 0,5 W/cm2.
Rezumat — Spectroscopia de absorbție UV-vizibilă a fost utilizată pentru a studia proprietățile de auto-asamblare ale minereului în amestecuri de DMF și apă în diferite rapoarte.După cum se arată în fig.2B, RuDA prezintă benzi de absorbție de la 600 la 900 nm în DMF cu o bandă de absorbție maximă la 729 nm.Creșterea cantității de apă a dus la o schimbare treptată spre roșu a maximului de absorbție a minereului la 800 nm, ceea ce indică agregarea J a minereului în sistemul asamblat.Spectrele de fotoluminiscență ale RuDA în diferiți solvenți sunt prezentate în Figura suplimentară 6. RuDA pare să prezinte luminiscență tipică NIR-II cu o lungime de undă de emisie maximă de cca.1050 nm în CH2Cl2 și, respectiv, CH3OH.Deplasarea mare Stokes (aproximativ 300 nm) a RuDA indică o schimbare semnificativă în geometria stării excitate și formarea stărilor excitate cu energie scăzută.Randamentele cuantice de luminiscență ale minereului în CH2Cl2 și CH3OH au fost determinate a fi de 3,3 și, respectiv, 0,6%.Totuși, într-un amestec de metanol și apă (5/95, v/v), s-a observat o ușoară deplasare spre roșu a emisiei și o scădere a randamentului cuantic (0,22%), care se poate datora auto-asamblarii minereului. .
Pentru a vizualiza auto-asamblarea ORE, am folosit microscopia cu forță atomică lichidă (AFM) pentru a vizualiza modificările morfologice ale ORE în soluția de metanol după adăugarea apei.Când conținutul de apă a fost sub 80%, nu s-a observat nicio agregare clară (Fig. 7 suplimentară).Cu toate acestea, cu o creștere suplimentară a conținutului de apă la 90–95%, au apărut nanoparticule mici, care au indicat auto-asamblarea de minereu. În plus, iradierea cu laser cu o lungime de undă de 808 nm nu a afectat intensitatea absorbției RuDA în soluții apoase. soluție (Fig. 2C și Fig. 8 suplimentară).În schimb, absorbanța verdelui de indocianină (ICG ca control) a scăzut rapid la 779 nm, indicând o excelentă fotostabilitate a RuDA.În plus, stabilitatea RuDA-NP-urilor în PBS (pH = 5,4, 7,4 și 9,0), 10% FBS și DMEM (glucoză ridicată) a fost examinată prin spectroscopie de absorbție UV-vizibilă în diferite momente.După cum se arată în Figura 9 suplimentară, s-au observat ușoare modificări ale benzilor de absorbție RuDA-NP în PBS la pH 7,4/9,0, FBS și DMEM, indicând o stabilitate excelentă a RuDA-NP.Cu toate acestea, într-un mediu acid (рН = 5,4) a fost găsită hidroliza minereului.De asemenea, am evaluat în continuare stabilitatea RuDA și RuDA-NP folosind metode de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC).După cum se arată în Figura suplimentară 10, RuDA a fost stabil într-un amestec de metanol și apă (50/50, v/v) pentru prima oră, iar hidroliza a fost observată după 4 ore.Cu toate acestea, doar un vârf larg concav-convex a fost observat pentru NP RuDA.Prin urmare, a fost utilizată cromatografia de permeație cu gel (GPC) pentru a evalua stabilitatea NP-urilor RuDA în PBS (pH = 7,4).După cum se arată în Figura suplimentară 11, după 8 ore de incubare în condițiile testate, înălțimea vârfului, lățimea vârfului și zona vârfului NP RuDA nu s-au schimbat semnificativ, indicând o stabilitate excelentă a NP RuDA.În plus, imaginile TEM au arătat că morfologia nanoparticulelor RuDA-NP a rămas practic neschimbată după 24 de ore în tampon PBS diluat (pH = 7,4, Fig. 12 suplimentară).
Deoarece auto-asamblarea poate conferi diferite caracteristici funcționale și chimice minereului, am observat eliberarea acidului 9,10-antracendiilbis(metilen)dimalonic (ABDA, indicator 1O2) în amestecurile metanol-apă.Minereu cu conținut diferit de apă50.După cum se arată în Figura 2D și în Figura 13 suplimentară, nu s-a observat nicio degradare a ABDA atunci când conținutul de apă a fost sub 20%.Odată cu o creștere a umidității la 40%, a avut loc degradarea ABDA, evidențiată de o scădere a intensității fluorescenței ABDA.De asemenea, sa observat că un conținut mai mare de apă are ca rezultat o degradare mai rapidă, ceea ce sugerează că auto-asamblarea RuDA este necesară și benefică pentru degradarea ABDA.Acest fenomen este foarte diferit de cromoforii moderni ACQ (agregation-induced quenching).Când este iradiat cu un laser cu o lungime de undă de 808 nm, randamentul cuantic de 1O2 RuDA într-un amestec de 98% H2O/2% DMF este de 16,4%, ceea ce este de 82 de ori mai mare decât cel al ICG (ΦΔ = 0,2%)51, demonstrând un randament remarcabil de generare 1O2 RuDA în stare de agregare.
Spiri de electroni folosind 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidinonă (TEMP) și 5,5-dimetil-1-pirolină N-oxid (DMPO) ca capcane de spin Spectroscopia de rezonanță (ESR) a fost utilizată pentru a identifica speciile rezultate AFK.de RuDA.După cum se arată în Figura suplimentară 14, s-a confirmat că 1O2 este generat la timpi de iradiere între 0 și 4 minute.În plus, când RuDA a fost incubat cu DMPO sub iradiere, a fost detectat un semnal tipic EPR cu patru linii de aduct DMPO-OH· 1:2:2:1, indicând formarea de radicali hidroxil (OH·).În general, rezultatele de mai sus demonstrează capacitatea RuDA de a stimula producția de ROS printr-un proces dublu de fotosensibilizare de tip I/II.
Pentru a înțelege mai bine proprietățile electronice ale RuDA în forme monomerice și agregate, orbitalii moleculari de frontieră ai RuDA în forme monomerice și dimerice au fost calculați folosind metoda DFT.După cum se arată în fig.3A, cel mai înalt orbital molecular ocupat (HOMO) al RuDA monomeric este delocalizat de-a lungul coloanei vertebrale ligandului, iar cel mai jos orbital molecular neocupat (LUMO) este centrat pe unitatea acceptor TDP.Dimpotrivă, densitatea de electroni din HOMO dimeric este concentrată pe ligandul unei molecule RuDA, în timp ce densitatea de electroni din LUMO este concentrată în principal pe unitatea acceptoare a altei molecule RuDA, ceea ce indică faptul că RuDA este în dimer.Caracteristicile CT.
A HOMO și LUMO de minereu sunt calculate în forme monomerice și dimerice.B Nivelurile de energie singlet și triplet ale minereului în monomeri și dimeri.C Niveluri estimate de RuDA și canale ISC posibile ca C monomeric și D dimeric. Săgețile indică canale ISC posibile.
Distribuția electronilor și a găurilor în stările excitate cu singlet de joasă energie ale RuDA în formele monomerice și dimerice a fost analizată folosind software-ul Multiwfn 3.852.53, care au fost calculate folosind metoda TD-DFT.După cum este indicat pe eticheta suplimentară.După cum se arată în figurile 1-2, găurile RDA monomerice sunt în mare parte delocalizate de-a lungul coloanei vertebrale ligandului în aceste stări excitate singlet, în timp ce electronii sunt localizați în principal în grupul TDP, demonstrând caracteristicile intramoleculare ale CT.În plus, pentru aceste stări excitate singlet, există mai mult sau mai puțină suprapunere între găuri și electroni, ceea ce sugerează că aceste stări excitate singlet au o anumită contribuție din excitația locală (LE).Pentru dimeri, pe lângă caracteristicile CT intramoleculare și LE, s-au observat o anumită proporție de caracteristici CT intermoleculare în stările respective, în special S3, S4, S7 și S8, pe baza analizei CT intermoleculare, cu tranzițiile intermoleculare CT ca principale (Tabel suplimentar).3).
Pentru a înțelege mai bine rezultatele experimentale, am explorat în continuare proprietățile stărilor excitate RuDA pentru a explora diferențele dintre monomeri și dimeri (Tabelele suplimentare 4-5).După cum se arată în Figura 3B, nivelurile de energie ale stărilor excitate singlet și triplet ale dimerului sunt mult mai dense decât cele ale monomerului, ceea ce ajută la reducerea decalajului de energie dintre S1 și Tn. S-a raportat că tranzițiile ISC ar putea fi realizate într-un mic decalaj energetic (ΔES1-Tn < 0,3 eV) între S1 și Tn54. S-a raportat că tranzițiile ISC ar putea fi realizate într-un mic decalaj energetic (ΔES1-Tn < 0,3 eV) între S1 și Tn54. Сообщалось, что переходы ISC могут быть реализованы в пределах небольшой энергоды энергеть энергети энергеть энергеть энергеть S-a raportat că tranzițiile ISC pot fi realizate într-un mic decalaj energetic (ΔES1-Tn <0,3 eV) între S1 și Tn54.据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。据报道，ISC 跃迁可以在S1 和Tn54 之间的小能隙（ΔES1-Tn < 0,3 eV）内实现。 Сообщалось, что переход ISC может быть реализован в пределах небольшой энергельшой энергетой энергетой че1зован Сообщалось S-a raportat că tranziția ISC poate fi realizată într-un mic decalaj energetic (ΔES1-Tn < 0,3 eV) între S1 și Tn54.În plus, un singur orbital, ocupat sau neocupat, trebuie să difere în stările singlet și triplet legate pentru a furniza o integrală SOC diferită de zero.Astfel, pe baza analizei energiei de excitație și a tranziției orbitale, toate canalele posibile ale tranziției ISC sunt prezentate în Fig.3C,D.În special, un singur canal ISC este disponibil în monomer, în timp ce forma dimerică are patru canale ISC care pot îmbunătăți tranziția ISC.Prin urmare, este rezonabil să presupunem că cu cât sunt mai multe molecule RuDA agregate, cu atât canalele ISC vor fi mai accesibile.Prin urmare, agregatele RuDA pot forma structuri electronice cu două benzi în stările singlet și triplet, reducând decalajul de energie dintre S1 și Tn disponibil, crescând astfel eficiența ISC pentru a facilita generarea de 1O2.
Pentru a elucida în continuare mecanismul de bază, am sintetizat un compus de referință al complexului arenă-Ru(II) (RuET) prin înlocuirea a două grupări etil cu două grupări trifenilamină fenil în RuDA (Fig. 4A, pentru caracterizarea completă, vezi ESI, Suplimentar 15). -21) De la donor (dietilamină) la acceptor (TDF), RuET are aceleași caracteristici intramoleculare CT ca RuDA.După cum era de așteptat, spectrul de absorbție al RuET în DMF a arătat o bandă de transfer de sarcină de energie scăzută cu absorbție puternică în regiunea infraroșu apropiat în regiunea de 600-1100 nm (Fig. 4B).În plus, agregarea RuET a fost observată și cu creșterea conținutului de apă, care s-a reflectat în deplasarea spre roșu a maximului de absorbție, care a fost confirmată în continuare de imagistica AFM lichidă (Fig. 22 suplimentară).Rezultatele arată că RuET, ca și RuDA, poate forma stări intramoleculare și se poate autoasambla în structuri agregate.
Structura chimică a RuET.B Spectrele de absorbție ale RuET în amestecuri de diferite rapoarte de DMF și apă.Parcele C EIS Nyquist pentru RuDA și RuET.Răspunsurile fotocurentului D ale RuDA și RuET sub acțiunea radiației laser cu o lungime de undă de 808 nm.
Fotodegradarea ABDA în prezența RuET a fost evaluată prin iradiere cu un laser cu o lungime de undă de 808 nm.În mod surprinzător, nu a fost observată nicio degradare a ABDA în diferite fracțiuni de apă (Fig. 23 suplimentară).Un posibil motiv este că RuET nu poate forma eficient o structură electronică cu bandă, deoarece lanțul etil nu promovează transferul eficient de sarcină intermoleculară.Prin urmare, au fost efectuate spectroscopie de impedanță electrochimică (EIS) și măsurători de fotocurent tranzitoriu pentru a compara proprietățile fotoelectrochimice ale RuDA și RuET.Conform diagramei Nyquist (Figura 4C), RuDA arată o rază mult mai mică decât RuET, ceea ce înseamnă că RuDA56 are un transport de electroni intermoleculari mai rapid și o conductivitate mai bună.În plus, densitatea fotocurentului RuDA este mult mai mare decât cea a RuET (Fig. 4D), confirmând eficiența mai bună a transferului de sarcină a RuDA57.Astfel, gruparea fenil a trifenilaminei din minereu joacă un rol important în asigurarea transferului de sarcină intermoleculară și formarea unei structuri electronice cu bandă.
Pentru a crește acumularea tumorii și biocompatibilitatea in vivo, am încapsulat în continuare RuDA cu F127.Diametrul hidrodinamic mediu al RuDA-NPs a fost determinat a fi de 123,1 nm cu o distribuție îngustă (PDI = 0,089) utilizând metoda împrăștierii dinamice a luminii (DLS) (Figura 5A), care a promovat acumularea tumorii prin creșterea permeabilității și retenției.efect EPR).Imaginile TEM au arătat că Ore NPs au o formă sferică uniformă, cu un diametru mediu de 86 nm.În special, maximul de absorbție al RuDA-NP-urilor a apărut la 800 nm (Fig. 24 suplimentară), indicând faptul că RuDA-NP-urile pot păstra funcțiile și proprietățile RuDA-urilor auto-asamblate.Randamentul cuantic ROS calculat pentru NP Ore este de 15,9%, ceea ce este comparabil cu Ore. Proprietățile fototermale ale NP RuDA au fost studiate sub acțiunea radiației laser cu o lungime de undă de 808 nm folosind o cameră în infraroșu.După cum se arată în fig.5B,C, grupul de control (numai PBS) a experimentat o ușoară creștere a temperaturii, în timp ce temperatura soluției RuDA-NPs a crescut rapid odată cu creșterea temperaturii (ΔT) la 15,5, 26,1 și 43,0°C.Concentrațiile mari au fost de 25, 50 și, respectiv, 100 pM, ceea ce indică un efect fototermic puternic al RuDA NPs.În plus, au fost efectuate măsurători ale ciclului de încălzire/răcire pentru a evalua stabilitatea fototermică a RuDA-NP și a compara cu ICG.Temperatura NP-urilor de minereu nu a scăzut după cinci cicluri de încălzire/răcire (Fig. 5D), ceea ce indică stabilitatea fototermală excelentă a NP-urilor de minereu.În schimb, ICG prezintă o stabilitate fototermală mai mică, așa cum se vede din dispariția aparentă a platoului de temperatură fototermică în aceleași condiții.Conform metodei anterioare58, eficiența de conversie fototermală (PCE) a RuDA-NP a fost calculată ca fiind de 24,2%, ceea ce este mai mare decât materialele fototermale existente, cum ar fi nanotodulele de aur (21,0%) și nanoshell-urile de aur (13,0%)59.Astfel, NP Ore prezintă proprietăți fototermale excelente, ceea ce îi face agenți PTT promițători.
Analiza imaginilor DLS și TEM ale NP-urilor RuDA (inserție).B Imagini termice ale diferitelor concentrații de RuDA NP expuse la radiații laser la o lungime de undă de 808 nm (0,5 W cm-2).C Curbele de conversie fototermică ale diferitelor concentrații de minereu NP, care sunt date cantitative.B. D Creșterea temperaturii ORE NP și ICG pe 5 cicluri de încălzire-răcire.
Fotocitotoxicitatea RuDA NP împotriva celulelor canceroase de sân umane MDA-MB-231 a fost evaluată in vitro.După cum se arată în fig.6A, B, RuDA-NP-urile și RuDA au prezentat citotoxicitate neglijabilă în absența iradierii, ceea ce implică o toxicitate întunecată mai mică a RuDA-NP-urilor și RuDA.Cu toate acestea, după expunerea la radiații laser la o lungime de undă de 808 nm, NP-urile RuDA și RuDA au arătat o fotocitotoxicitate puternică împotriva celulelor canceroase MDA-MB-231 cu valori IC50 (concentrație inhibitoare la jumătatea maximă) de 5,4 și, respectiv, 9,4 μM, demonstrând că RuDA-NP și RuDA au potențial pentru fototerapie cancerului.În plus, fotocitotoxicitatea RuDA-NP și RuDA a fost investigată în continuare în prezența vitaminei C (Vc), un captator de ROS, pentru a elucida rolul ROS în citotoxicitatea indusă de lumină.Evident, viabilitatea celulară a crescut după adăugarea Vc, iar valorile IC50 ale NP-urilor RuDA și RuDA au fost de 25,7, respectiv 40,0 μM, ceea ce demonstrează rolul important al ROS în fotocitotoxicitatea NP-urilor RuDA și RuDA.Citotoxicitatea indusă de lumină a RuDA-NP-urilor și RuDA în celulele canceroase MDA-MB-231 prin colorarea celulelor vii/moarte folosind calceină AM (fluorescență verde pentru celule vii) și iodură de propidiu (PI, fluorescență roșie pentru celulele moarte).confirmate de celule) ca sonde fluorescente.Așa cum se arată în Figura 6C, celulele tratate cu RuDA-NP sau RuDA au rămas viabile fără iradiere, așa cum este demonstrat de fluorescența verde intensă.Dimpotrivă, sub iradiere cu laser s-a observat doar fluorescență roșie, ceea ce confirmă fotocitotoxicitatea efectivă a RuDA sau RuDA NPs.Este de remarcat faptul că fluorescența verde a apărut la adăugarea de Vc, ceea ce indică o încălcare a fotocitotoxicității RuDA și RuDA NP.Aceste rezultate sunt în concordanță cu testele de fotocitotoxicitate in vitro.
Viabilitatea dependentă de doză a celulelor A RuDA- și B RuDA-NP în celulele MDA-MB-231 în prezența sau absența Vc (0,5 mM), respectiv.Bare de eroare, medie ± abatere standard (n = 3). Teste t nepereche, cu două fețe *p < 0,05, **p < 0,01 și ***p < 0,001. Teste t nepereche, cu două fețe *p < 0,05, **p < 0,01 și ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 și ***p <0,001. Teste t cu două cozi nepereche *p<0,05, **p<0,01 și ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Teste t cu două cozi nepereche *p<0,05, **p<0,01 și ***p<0,001.C Analiza colorării celulelor vii/moarte folosind calceină AM și iodură de propidiu ca sonde fluorescente.Bară de scară: 30 µm.Sunt prezentate imagini reprezentative cu trei repetări biologice din fiecare grup.D Imagini de fluorescență confocale ale producției de ROS în celulele MDA-MB-231 în diferite condiții de tratament.Fluorescența DCF verde indică prezența ROS.Se iradiază cu un laser cu o lungime de undă de 808 nm cu o putere de 0,5 W/cm2 timp de 10 minute (300 J/cm2).Bară de scară: 30 µm.Sunt prezentate imagini reprezentative cu trei repetări biologice din fiecare grup.E Analiză de tratament cu citometrie în flux RuDA-NPs (50 pM) sau RuDA (50 pM) cu sau fără laser de 808 nm (0,5 W cm-2) în prezența și absența Vc (0,5 mM) timp de 10 min.Sunt prezentate imagini reprezentative cu trei repetări biologice din fiecare grup.F Nrf-2, HSP70 și HO-1 ale celulelor MDA-MB-231 tratate cu RuDA-NPs (50 uM) cu sau fără iradiere laser de 808 nm (0,5 W cm-2, 10 min, 300 J cm-2), celulele exprimă 2).Sunt prezentate imagini reprezentative cu două repetări biologice din fiecare grup.
Producția intracelulară de ROS în celulele MDA-MB-231 a fost examinată folosind metoda de colorare cu 2,7-diclorodihidrofluorescein diacetat (DCFH-DA).După cum se arată în fig.6D, celulele tratate cu RuDA-NP-uri sau RuDA au prezentat fluorescență verde distinctă atunci când au fost iradiate cu laserul de 808 nm, ceea ce indică faptul că RuDA-NP-urile și RuDA au o capacitate eficientă de a genera ROS.Dimpotrivă, în absența luminii sau în prezența Vc, s-a observat doar un semnal slab fluorescent al celulelor, ceea ce a indicat o ușoară formare de ROS.Nivelurile intracelulare de ROS în celulele RuDA-NP și celulele MDA-MB-231 tratate cu RuDA au fost determinate în continuare prin citometrie în flux.După cum se arată în Figura suplimentară 25, intensitatea medie a fluorescenței (MFI) generată de RuDA-NP și RuDA sub iradierea laser de 808 nm a fost semnificativ crescută de aproximativ 5,1 și, respectiv, de 4,8 ori, comparativ cu grupul de control, confirmând formarea lor excelentă AFK.capacitate.Cu toate acestea, nivelurile intracelulare de ROS în celulele RuDA-NP sau MDA-MB-231 tratate cu RuDA au fost comparabile doar cu martorii fără iradiere cu laser sau în prezența Vc, similar cu rezultatele analizei fluorescenței confocale.
S-a demonstrat că mitocondriile sunt ținta principală a complexelor Ru(II)-arene60.Prin urmare, a fost investigată localizarea subcelulară a RuDA și RuDA-NP.După cum se arată în Figura 26 suplimentară, RuDA și RuDA-NP prezintă profiluri de distribuție celulară similare cu cea mai mare acumulare în mitocondrii (62,5 ± 4,3 și, respectiv, 60,4 ± 3,6 ng/mg proteină).Cu toate acestea, doar o cantitate mică de Ru a fost găsită în fracțiile nucleare ale minereului și minereului NP (3,5 și, respectiv, 2,1%).Fracția celulară rămasă a conținut ruteniu rezidual: 31,7% (30,6 ± 3,4 ng/mg proteină) pentru RuDA și 42,9% (47,2 ± 4,5 ng/mg proteină) pentru RuDA-NPs.În general, minereul și minereul NP se acumulează în principal în mitocondrii.Pentru a evalua disfuncția mitocondrială, am folosit colorarea JC-1 și MitoSOX Red pentru a evalua potențialul membranei mitocondriale și, respectiv, capacitatea de producție de superoxid.După cum se arată în Fig. 27 suplimentară, fluorescența verde intens (JC-1) și roșu (MitoSOX Red) a fost observată în celulele tratate atât cu RuDA, cât și cu RuDA-NP-uri sub iradiere cu laser de 808 nm, indicând faptul că atât RuDA, cât și RuDA-NP-uri sunt foarte fluorescente. Poate induce eficient depolarizarea membranei mitocondriale și producerea de superoxid.În plus, mecanismul morții celulare a fost determinat utilizând analiza pe bază de citometrie în flux a anexinei V-FITC/iodură de propidiu (PI).După cum se arată în Figura 6E, atunci când au fost iradiate cu laser de 808 nm, RuDA și RuDA-NP au indus o rată de apoptoză timpurie crescută semnificativ (cadrantul din dreapta jos) în celulele MDA-MB-231 în comparație cu PBS sau PBS plus laser.celulele procesate.Cu toate acestea, când a fost adăugat Vc, rata apoptozei RuDA și RuDA-NP a scăzut semnificativ de la 50,9% și 52,0% la 15,8% și respectiv 17,8%, ceea ce confirmă rolul important al ROS în fotocitotoxicitatea RuDA și RuDA-NP..În plus, au fost observate celule ușoare necrotice în toate grupurile testate (cadranul din stânga sus), sugerând că apoptoza poate fi forma predominantă de moarte celulară indusă de RuDA și RuDA-NP.
Deoarece deteriorarea stresului oxidativ este un determinant major al apoptozei, factorul nuclear asociat cu eritroida 2, factorul 2 (Nrf2) 62, un regulator cheie al sistemului antioxidant, a fost investigat în MDA-MB-231 tratat cu RuDA-NPs.Mecanismul de acțiune al NP-urilor RuDA indus de iradiere.În același timp, a fost de asemenea detectată expresia proteinei hem oxigenazei 1 (HO-1) din aval.După cum se arată în Figura 6F și în Figura 29 suplimentară, fototerapia mediată de RuDA-NP a crescut nivelurile de expresie Nrf2 și HO-1 în comparație cu grupul PBS, indicând faptul că RuDA-NP-urile pot stimula căile de semnalizare a stresului oxidativ.În plus, pentru a studia efectul fototermic al RuDA-NPs63, a fost evaluată și expresia proteinei de șoc termic Hsp70.Este clar că celulele tratate cu iradiere cu laser RuDA-NPs + 808 nm au arătat o expresie crescută a Hsp70 în comparație cu celelalte două grupuri, reflectând un răspuns celular la hipertermie.
Rezultatele remarcabile in vitro ne-au determinat să investigăm performanța in vivo a RuDA-NP la șoarecii nuzi cu tumori MDA-MB-231.Distribuția tisulară a RuDA NPs a fost studiată prin determinarea conținutului de ruteniu în ficat, inimă, splină, rinichi, plămâni și tumori.După cum se arată în fig.7A, conținutul maxim de NP de minereu în organele normale a apărut la prima oră de observare (4 ore), în timp ce conținutul maxim a fost determinat în țesuturile tumorale la 8 ore după injectare, posibil din cauza NP de minereu.Efectul EPR al LF.Conform rezultatelor distribuției, durata optimă a tratamentului cu minereu NP a fost luată la 8 ore după administrare.Pentru a ilustra procesul de acumulare a RuDA-NP-urilor în situsurile tumorale, proprietățile fotoacustice (PA) ale RuDA-NP-urilor au fost monitorizate prin înregistrarea semnalelor PA ale RuDA-NP-urilor la momente diferite după injectare.În primul rând, semnalul PA al RuDA-NP in vivo a fost evaluat prin înregistrarea imaginilor PA ale unui loc tumoral după injectarea intratumorală de RuDA-NP.După cum se arată în Figura suplimentară 30, RuDA-NP-urile au prezentat un semnal PA puternic și a existat o corelație pozitivă între concentrația RuDA-NP și intensitatea semnalului PA (Figura suplimentară 30A).Apoi, imaginile PA in vivo ale locurilor tumorale au fost înregistrate după injectarea intravenoasă de RuDA și RuDA-NP la momente diferite după injectare.După cum se arată în Figura 7B, semnalul PA al RuDA-NP-urilor de la locul tumorii a crescut treptat cu timpul și a atins un platou la 8 ore după injectare, în concordanță cu rezultatele distribuției tisulare determinate prin analiza ICP-MS.În ceea ce privește RuDA (Figura suplimentară 30B), intensitatea maximă a semnalului PA a apărut la 4 ore după injectare, indicând o rată rapidă de intrare a RuDA în tumoră.În plus, comportamentul excretor al RuDA și RuDA-NPs a fost investigat prin determinarea cantității de ruteniu din urină și fecale folosind ICP-MS.Principala cale de eliminare pentru RuDA (Figura 31 suplimentară) și RuDA-NP (Fig. 7C) este prin fecale, iar clearance-ul eficient al RuDA și RuDA-NP a fost observat în timpul perioadei de studiu de 8 zile, ceea ce înseamnă că RuDA și RuDA-NP-urile pot elimina eficient din organism fără toxicitate pe termen lung.
A. Distribuția ex vivo a RuDA-NP în țesuturile de șoarece a fost determinată de conținutul de Ru (procentul din doza administrată de Ru (ID) per gram de țesut) la momente diferite după injectare.Datele sunt media ± abaterea standard (n = 3). Teste t nepereche, cu două fețe *p < 0,05, **p < 0,01 și ***p < 0,001. Teste t nepereche, cu două fețe *p < 0,05, **p < 0,01 și ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 și ***p <0,001. Teste t cu două cozi nepereche *p<0,05, **p<0,01 și ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Teste t cu două cozi nepereche *p<0,05, **p<0,01 și ***p<0,001.Imagini B PA ale situsurilor tumorale in vivo la excitație de 808 nm după administrarea intravenoasă de RuDA-NPs (10 umol kg-1) la diferite momente de timp.După administrarea intravenoasă de RuDA NPs (10 µmol kg-1), C Ru a fost excretat de la șoareci cu urină și fecale la diferite intervale de timp.Datele sunt media ± abaterea standard (n = 3).
Capacitatea de încălzire a RuDA-NP in vivo a fost studiată la șoareci nuzi cu tumori MDA-MB-231 și RuDA pentru comparație.După cum se arată în fig.8A și Fig. 32 suplimentară, grupul martor (soluție salină) a prezentat mai puține schimbări de temperatură (ΔT ≈ 3 °C) după 10 minute de expunere continuă.Cu toate acestea, temperatura RuDA-NPs și RuDA a crescut rapid cu temperaturi maxime de 55,2 și respectiv 49,9 ° C, oferind suficientă hipertermie pentru terapia cancerului in vivo.Creșterea observată a temperaturii ridicate pentru RuDA NPs (ΔT ≈ 24°C) în comparație cu RuDA (ΔT ≈ 19°C) se poate datora permeabilității sale mai bune și acumulării în țesuturile tumorale datorită efectului EPR.
Imagini termice în infraroșu ale șoarecilor cu tumori MDA-MB-231 iradiați cu laser de 808 nm la momente diferite la 8 ore după injectare.Sunt prezentate imagini reprezentative cu patru repetări biologice din fiecare grup.B Volumul relativ al tumorii și C Masa tumorală medie a diferitelor grupuri de șoareci în timpul tratamentului.D Curbele greutăților corporale ale diferitelor grupuri de șoareci.Se iradiază cu un laser cu o lungime de undă de 808 nm cu o putere de 0,5 W/cm2 timp de 10 minute (300 J/cm2).Bare de eroare, medie ± abatere standard (n = 3). Teste t nepereche, cu două fețe *p < 0,05, **p < 0,01 și ***p < 0,001. Teste t nepereche, cu două fețe *p < 0,05, **p < 0,01 și ***p < 0,001. Непарные двусторонние t-критерии *p <0,05, **p <0,01 și ***p <0,001. Teste t cu două cozi nepereche *p<0,05, **p<0,01 și ***p<0,001.未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。未配对的双边t 检验*p < 0,05、**p < 0,01 和***p < 0,001。 Непарные двусторонние t-тесты *p <0,05, **p <0,01 и ***p <0,001. Teste t cu două cozi nepereche *p<0,05, **p<0,01 și ***p<0,001. Imagini de colorare E H&E ale organelor și tumorilor majore din diferite grupuri de tratament, inclusiv grupele Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs și RuDA-NPs + Laser. Imagini de colorare E H&E ale organelor și tumorilor majore din diferite grupuri de tratament, inclusiv grupele Saline, Saline + Laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs și RuDA-NPs + Laser. Изображения окрашивания E H&E основных органов и опухолей из разных групп лечения, включая группы физиологического раствора, физиологического раствора + лазера, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NPs и RuDA-NPs + Laser. Imagini de colorare E H&E ale organelor și tumorilor majore din diferite grupuri de tratament, inclusiv ser fiziologic, soluție salină + laser, RuDA, RuDA + Laser, RuDA-NP și RuDA-NPs + grupe Laser.来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E 染色图像，包括盐水、盐水+ 来自不图像，包括盐水、盐水+ 来自不图像，包括盐水、盐水+ 态盐水+ 来自不倿 Ru DA〉 恅 Ru DAぉ来自不同治疗组的主要器官和肿瘤的E H&E Окрашивание E H&E основных органов и опухолей из различных групп лечения, включая физиологический раствор, физиологический раствор + лазер, RuDA, RuDA + лазер, RuDA-NPs и RuDA-NPs + лазер. Colorarea E H&E a organelor și tumorilor majore din diferite grupuri de tratament, inclusiv soluție salină, soluție salină + laser, RuDA, RuDA + laser, RuDA-NP și RuDA-NPs + laser.Bară de scară: 60 µm.
Efectul fototerapiei in vivo cu RuDA și RuDA NPs a fost evaluat în care șoarecii goi cu tumori MDA-MB-231 au fost injectați intravenos cu RuDA sau RuDA NP la o singură doză de 10,0 µmol kg-1 prin vena cozii și apoi 8 ore după injectare.iradiere laser cu o lungime de undă de 808 nm.După cum se arată în Figura 8B, volumele tumorii au crescut semnificativ în grupele cu soluție salină și cu laser, indicând faptul că iradierea cu soluție salină sau cu laser 808 a avut un efect redus asupra creșterii tumorii.Ca și în grupul cu soluție salină, creșterea rapidă a tumorii a fost observată și la șoarecii tratați cu RuDA-NP sau RuDA în absența iradierii cu laser, demonstrând toxicitatea lor scăzută la întuneric.În schimb, după iradierea cu laser, atât tratamentul cu RuDA-NP, cât și cu RuDA au indus o regresie semnificativă a tumorii, cu reduceri ale volumului tumorii de 95,2% și, respectiv, 84,3%, comparativ cu grupul tratat cu soluție salină, indicând PDT sinergică excelentă., mediat de efectul RuDA/CHTV.– NP sau Ore. În comparație cu RuDA, RuDA NPs au prezentat un efect fototerapeutic mai bun, care s-a datorat în principal efectului EPR al RuDA NPs.Rezultatele inhibării creșterii tumorii au fost evaluate în continuare prin greutatea tumorii excizată în ziua 15 de tratament (Fig. 8C și Fig. 33 suplimentară).Masa medie a tumorii la șoarecii tratați cu RuDA-NP și la șoarecii tratați cu RuDA a fost de 0,08 și, respectiv, 0,27 g, ceea ce a fost mult mai ușor decât în grupul de control (1,43 g).
În plus, greutatea corporală a șoarecilor a fost înregistrată la fiecare trei zile pentru a studia toxicitatea întunecată a RuDA-NP-urilor sau RuDA in vivo.După cum se arată în Figura 8D, nu au fost observate diferențe semnificative în greutatea corporală pentru toate grupurile de tratament. Mai mult, a fost efectuată colorarea cu hematoxilină și eozină (H&E) a organelor majore (inima, ficatul, splina, plămânul și rinichiul) din diferite grupuri de tratament. Mai mult, a fost efectuată colorarea cu hematoxilină și eozină (H&E) a organelor majore (inima, ficatul, splina, plămânul și rinichiul) din diferite grupuri de tratament. Кроме того, было проведено окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) из разных групп лечения. În plus, a fost efectuată colorarea cu hematoxilină și eozină (H&E) a organelor majore (inima, ficatul, splina, plămânii și rinichii) din diferite grupuri de tratament.此外，对不同治疗组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行芏）进行苲忛行苊 (EL) Кроме того, проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) основных органов (сердца, печени, селезенки, легких и почек) в различных группах лечения. În plus, colorarea cu hematoxilină și eozină (H&E) a organelor majore (inima, ficatul, splina, plămânul și rinichiul) a fost efectuată în diferite grupuri de tratament.După cum se arată în Fig.8E, imaginile de colorare H&E a cinci organe majore din grupurile RuDA-NP și RuDA nu prezintă anomalii evidente sau leziuni ale organelor. 8E, imaginile de colorare H&E a cinci organe majore din grupurile RuDA-NP și RuDA nu prezintă anomalii evidente sau leziuni ale organelor.După cum se arată în fig.8E, изображения окрашивания H&E пяти основных органов из групп RuDA-NPs и RuDA не демонстрируюти оримонстрируют польния Imaginile de colorare 8E, H&E ale cinci organe majore din grupurile RuDA-NP și RuDA nu prezintă anomalii sau leziuni evidente ale organelor.如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E 染色图像没有显示傘显示傘显示出显示出显接如图8E 所示，来自RuDA-NPs 和RuDA 组的五个主要器官的H&E Как показано на рисунке 8e, изображения окрашивания h & e пяти основных оранов з грали agistru я а а н нoare. După cum se arată în Figura 8E, imaginile de colorare H&E ale celor cinci organe majore din grupurile RuDA-NP și RuDA nu au prezentat anomalii evidente sau leziuni ale organelor.Aceste rezultate au arătat că nici RuDA-NP, nici RuDA nu au prezentat semne de toxicitate in vivo. Mai mult, imaginile de colorare H&E ale tumorilor au arătat că atât grupurile RuDA + Laser, cât și RuDA-NPs + Laser ar putea provoca distrugerea severă a celulelor canceroase, demonstrând excelenta eficacitate fototerapeutică in vivo a RuDA și RuDA-NPs. Mai mult, imaginile de colorare H&E ale tumorilor au arătat că atât grupurile RuDA + Laser, cât și RuDA-NPs + Laser ar putea provoca distrugerea severă a celulelor canceroase, demonstrând excelenta eficacitate fototerapeutică in vivo a RuDA și RuDA-NPs.În plus, imaginile tumorale colorate cu hematoxilină-eozină au arătat că atât grupurile RuDA+Laser, cât și RuDA-NPs+Laser pot induce distrugerea severă a celulelor canceroase, demonstrând eficacitatea fototerapeutică superioară a RuDA și RuDA-NPs in vivo.此外 ， 肿瘤 的 h & e 染色 图像 显示 ， ru rudo + laser 和 rudi-nps + laser 组均 可 导致 严重 的 癌细胞 破坏 ， 证明 了 RUDA 和 RUDA-NPS 的 优异 的 体内 光疗 功效。。。 和 RUDA-NPS 的 优异 的 体内 光疗 功效。。此外 ， 肿瘤 的 & e 染色 ， ， rudo + Laser 和 RUDA-NPS + LASER 组均 导致 的 癌 细胞 破坏 ， 证明 了 RUDA 和 RUDA-NPS 的 的 体内 光疗 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。。。。。。。。。。。 。。。În plus, imaginile tumorale colorate cu hematoxilină și eozină au arătat că atât grupurile RuDA+Laser, cât și RuDA-NPs+Laser au dus la distrugerea severă a celulelor canceroase, demonstrând eficacitatea fototerapeutică superioară a RuDA și RuDA-NPs in vivo.
În concluzie, complexul organometalic Ru(II)-arenă (RuDA) cu liganzi de tip DA a fost proiectat pentru a facilita procesul ISC folosind metoda de agregare.RuDA sintetizat se poate auto-asambla prin interacțiuni non-covalente pentru a forma sisteme supramoleculare derivate din RuDA, facilitând astfel formarea 1O2 și conversia fototermală eficientă pentru terapia cancerului indusă de lumină.Este de remarcat faptul că RuDA monomer nu a generat 1O2 sub iradiere cu laser la 808 nm, dar ar putea genera o cantitate mare de 1O2 în stare agregată, demonstrând raționalitatea și eficiența designului nostru.Studiile ulterioare au arătat că ansamblul supramolecular înzestrează RuDA cu proprietăți fotofizice și fotochimice îmbunătățite, cum ar fi absorbția deplasării spre roșu și rezistența la fotoalbire, care sunt foarte de dorit pentru procesarea PDT și PTT.Atât experimentele in vitro, cât și in vivo au arătat că NP-urile RuDA cu o bună biocompatibilitate și o bună acumulare în tumoră prezintă o activitate anticanceroasă excelentă indusă de lumină la iradierea cu laser la o lungime de undă de 808 nm.Astfel, RuDA NPs ca reactivi supramoleculari bimodali eficienți PDT/PTW vor îmbogăți setul de fotosensibilizatori activați la lungimi de undă de peste 800 nm.Designul conceptual al sistemului supramolecular oferă o cale eficientă pentru fotosensibilizatorii activați de NIR, cu efecte excelente de fotosensibilizare.
Toate substanțele chimice și solvenții au fost obținuți de la furnizori comerciali și utilizați fără purificare suplimentară.RuCl3 a fost achiziționat de la Boren Precious Metals Co., Ltd. (Kunming, China).[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dionă) și 4,7-bis[4-(N,N-difenilamino)fenil]-5 ,6-Diamino-2,1,3-benzotiadiazol a fost sintetizat conform studiilor anterioare64,65.Spectrele RMN au fost înregistrate pe un spectrometru Bruker Avance III-HD 600 MHz la Southeastern University Analytical Test Center folosind d6-DMSO sau CDCl3 ca solvent.Deplasările chimice δ sunt date în ppm.față de tetrametilsilan, iar constantele de interacțiune J sunt date în valori absolute în herți.Spectrometria de masă de înaltă rezoluție (HRMS) a fost efectuată pe un instrument Agilent 6224 ESI/TOF MS.Analiza elementară a C, H și N a fost efectuată pe un analizor elementar Vario MICROCHNOS (Elementar).Spectrele UV-vizibile au fost măsurate pe un spectrofotometru Shimadzu UV3600.Spectrele de fluorescență au fost înregistrate pe un spectrofluorimetru Shimadzu RF-6000.Spectrele EPR au fost înregistrate pe un instrument Bruker EMXmicro-6/1.Morfologia și structura probelor preparate au fost studiate pe instrumente FEI Tecnai G20 (TEM) și Bruker Icon (AFM) care funcționează la o tensiune de 200 kV.Difuzarea dinamică a luminii (DLS) a fost efectuată pe un analizor Nanobrook Omni (Brookhaven).Proprietățile fotoelectrochimice au fost măsurate pe o configurație electrochimică (CHI-660, China).Imaginile fotoacustice au fost obținute folosind sistemul FUJIFILM VisualSonics Vevo® LAZR.Imaginile confocale au fost obținute folosind un microscop confocal Olympus FV3000.Analiza FACS a fost efectuată pe un citometru de flux BD Calibur.Experimentele de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) au fost efectuate pe un sistem Waters Alliance e2695 folosind un detector UV/Vis 2489.Testele de cromatografie de permeabilitate cu gel (GPC) au fost înregistrate pe un instrument Thermo ULTIMATE 3000 folosind un detector de indice de refracție ERC RefratoMax520.
[(η6-p-cym)Ru(fendio)Cl]Cl (fendio = 1,10-fenantrolin-5,6-dionă)64 (481,0 mg, 1,0 mmol), 4,7-bis[4 -(N, N-difenilamino)fenil]-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol 65 (652,0 mg, 1,0 mmol) şi acid acetic glacial (30 mL) au fost agitate la frigider cu reflux timp de 12 ore.Solventul a fost apoi îndepărtat in vacuo folosind un evaporator rotativ.Reziduul rezultat a fost purificat prin cromatografie rapidă pe coloană (silicagel, CH2CI2:MeOH=20:1) pentru a obţine RuDA sub formă de pulbere verde (randament: 877,5 mg, 80%).anus.Calculat pentru C64H48CI2N8RuS: C 67,84, H 4,27, N 9,89.Găsit: C 67,92, H 4,26, N 9,82.1H RMN (600 MHz, d6-DMSO) 5 10,04 (s, 2H), 8,98 (s, 2H), 8,15 (s, 2H), 7,79 (s, 4H), 7,44 (s, 8H), 7,21 (d, J = 31,2 Hz, 16H), 6,47 (s, 2H), 6,24 (s, 2H), 2,69 (s, 1 H), 2,25 (s, 3H), 0,99 (s, 6H).13C RMN (150 MHz, D6-DMSO), δ (PPM) 158.03, 152.81, 149.31, 147.98, 147.16, 139.98, 136.21, 135.57, 134.68, 130.34, 130,02, 128.68, 128.01, 125.51, 124.45, 120. , 103. , 86,52, 84,75, 63,29, 30,90, 22,29, 18,83.ESI-MS: m/z [M-CI]+ = 1097,25.
Sinteza 4,7-bis[4-(N,N-dietilamino)fenil-5,6-diamino-2,1,3-benzotiadiazol (L2): L2 a fost sintetizat în două etape.Pd(PPh3)4 (46 mg, 0,040 mmol) a fost adăugat la N,N-dietil-4-(tributilstannil)anilină (1,05 g, 2,4 mmol) și 4,7-dibrom-5,6-dinitro soluție - 2, 1,3-benzotiadiazol (0,38 g, 1,0 mmol) în toluen uscat (100 ml).Amestecul a fost agitat la 100°C timp de 24 de ore.După îndepărtarea toluenului în vid, solidul rezultat a fost spălat cu eter de petrol.Apoi, un amestec din acest compus (234,0 mg, 0,45 mmoli) şi pulbere de fier (0,30 g, 5,4 mmoli) în acid acetic (20 ml) a fost agitat la 80°C timp de 4 ore.Amestecul de reacţie a fost turnat în apă şi solidul brun rezultat a fost colectat prin filtrare.Produsul a fost purificat de două ori prin sublimare în vid pentru a da un solid verde (126,2 mg, randament 57%).anus.Calculat pentru C26H32N6S: C 67,79, H 7,00, N 18,24.Găsit: C 67,84, H 6,95, H 18,16.1H RMN (600 MHz, CDCI3), 5 (ppm) 7,42 (d, 4H), 6,84 (d, 4H), 4,09 (s, 4H), 3,42 (d, 8H), 1,22 (s, 12H).13C RMN (150 MHz, CDCI3), 5 (ppm) 151,77, 147,39, 138,07, 131,20, 121,09, 113,84, 111,90, 44,34, 12,77.ESI-MS: m/z [M+H]+ = 461,24.
Compușii au fost preparați și purificați urmând proceduri similare cu RuDA.anus.Calculat pentru C48H48CI2N8RuS: C 61,27, H 5,14, N 11,91.Găsit: C, 61,32, H, 5,12, N, 11,81, 1H RMN (600 MHz, d6-DMSO), 5 (ppm) 10,19 (s, 2H), 9,28 (s, 2H), 8,09 (s, 2H), 7,95 (s, 4H), 6,93 (s, 4H), 6,48 (d, 2H), 6,34 (s, 2H), 3,54 (t, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,31 (t, 12H), 1,07 (s, 6H).13c nmr (151 mhz, CDCL3), δ (PPM) 158.20, 153.36, 148.82, 148.14, 138.59, 136.79, 135.75, 134.71, 130.44, 128.87, 128.35, 121.70, 111.84, 110.76, 105.07, 104.23, 87.0, 84.4., 38,06, 31,22, 29,69, 22,29, 19,19, 14,98, 12,93.ESI-MS: m/z [M-CI]+ = 905,24.
RuDA a fost dizolvat în MeOH/H2O (5/95, v/v) la o concentrație de 10 μM.Spectrul de absorbție al RuDA a fost măsurat la fiecare 5 minute pe un spectrofotometru Shimadzu UV-3600 sub iradiere cu lumină laser cu o lungime de undă de 808 nm (0,5 W/cm2).Spectrele ICG au fost înregistrate în aceleași condiții ca standardul.
Spectrele EPR au fost înregistrate pe un spectrometru Bruker EMXmicro-6/1 cu o putere a microundelor de 20 mW, un interval de scanare de 100 G și o modulație de câmp de 1 G. 2,2,6,6-tetrametil-4-piperidonă (TEMP) și 5,5-dimetil-1-pirolină N-oxid (DMPO) au fost utilizate ca capcane de spin.Spectrele de rezonanță de spin electronic au fost înregistrate pentru soluții mixte de RuDA (50 pM) și TEMF (20 mM) sau DMPO (20 mM) sub acțiunea radiației laser cu o lungime de undă de 808 nm (0,5 W/cm2).
Calculele DFT și TD-DFT pentru RuDA au fost efectuate la niveluri PBE1PBE/6–31 G*//LanL2DZ în soluție apoasă folosind programul Gaussian 1666,67,68.Distribuțiile HOMO-LUMO, gaura și electroni ale stării excitate de singlet cu energie joasă RuDA au fost reprezentate grafic folosind programul GaussView (versiunea 5.0).
Am încercat mai întâi să măsurăm eficiența de generare a 1O2 RuDA utilizând spectroscopie UV-vizibilă convențională cu ICG (ΦΔ = 0,002) ca standard, dar fotodegradarea ICG a afectat puternic rezultatele.Astfel, randamentul cuantic al 1O2 RuDA a fost măsurat prin detectarea unei modificări a intensității fluorescenței ABDA la aproximativ 428 nm atunci când a fost iradiat cu un laser cu o lungime de undă de 808 nm (0,5 W/cm2).Experimentele au fost efectuate pe RuDA și RuDA NP (20 μM) în apă/DMF (98/2, v/v) care conține ABDA (50 μM).Randamentul cuantic de 1O2 a fost calculat folosind următoarea formulă: ΦΔ (PS) = ΦΔ (ICG) × (rFS/APS)/(rICG/AICG).rPS și rICG sunt ratele de reacție ale ABDA cu 1O2 obținute din fotosensibilizator și, respectiv, ICG.APS și AICG sunt absorbanța fotosensibilizatorului și, respectiv, ICG la 808 nm.
Măsurătorile AFM au fost efectuate în condiții lichide folosind modul de scanare pe un sistem AFM Bruker Dimension Icon.Folosind o structură deschisă cu celule lichide, celulele au fost spălate de două ori cu etanol și uscate cu un curent de azot.Introduceți celulele uscate în capul optic al microscopului.Puneți imediat o picătură din probă în bazinul de lichid și puneți-o pe cantilever folosind o seringă sterilă de plastic de unică folosință și un ac steril.O altă picătură este plasată direct pe probă, iar când capul optic este coborât, cele două picături se contopesc, formând un menisc între probă și rezervorul de lichid.Măsurătorile AFM au fost efectuate folosind un cantilever de nitrură în formă de V SCANASYST-FLUID (Bruker, duritate k = 0,7 N m-1, f0 = 120–180 kHz).
Cromatogramele HPLC au fost obţinute pe un sistem Waters e2695 echipat cu o coloană Phoenix C18 (250 x 4,6 mm, 5 um) utilizând un detector 2489 UV/Vis.Lungimea de undă a detectorului este de 650 nm.Fazele mobile A și B au fost apă și, respectiv, metanol, iar debitul fazei mobile a fost de 1,0 ml·min-1.Gradientul (solventul B) a fost după cum urmează: 100% de la 0 la 4 minute, 100% la 50% de la 5 la 30 de minute şi resetat la 100% de la 31 la 40 de minute.Minereul a fost dizolvat într-o soluție mixtă de metanol și apă (50/50, în volum) la o concentrație de 50 μM.Volumul de injectare a fost de 20 μl.
Testele GPC au fost înregistrate pe un instrument Thermo ULTIMATE 3000 echipat cu două coloane PL aquagel-OH MIXED-H (2×300×7,5 mm, 8 µm) și un detector de indice de refracție ERC RefratoMax520.Coloana GPC a fost eluată cu apă la un debit de 1 ml/min la 30°C.NP-urile de minereu au fost dizolvate în soluție de PBS (pH = 7,4, 50 μM), volumul de injecție a fost de 20 μL.
Fotocurenții au fost măsurați pe o configurație electrochimică (CHI-660B, China).Răspunsurile optoelectronice atunci când laserul a fost pornit și oprit (808 nm, 0,5 W/cm2) au fost măsurate la o tensiune de 0,5 V într-o cutie neagră, respectiv.O celulă standard cu trei electrozi a fost utilizată cu un electrod de carbon sticlos în formă de L (GCE) ca electrod de lucru, un electrod standard de calomel (SCE) ca electrod de referință și un disc de platină ca contraelectrod.O soluție 0,1 M Na2S04 a fost utilizată ca electrolit.
Linia celulară de cancer de sân uman MDA-MB-231 a fost achiziționată de la KeyGEN Biotec Co., LTD (Nanjing, China, număr de catalog: KG033).Celulele au fost crescute în monostraturi în Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, glucoză ridicată) suplimentat cu o soluție de 10% ser fetal bovin (FBS), penicilină (100 μg/ml) și streptomicina (100 μg/ml).Toate celulele au fost cultivate la 37°C într-o atmosferă umedă care conține 5% CO2.
Testul MTT a fost utilizat pentru a determina citotoxicitatea RuDA și RuDA-NP în prezența și absența iradierii luminoase, cu sau fără Vc (0,5 mM).Celulele canceroase MDA-MB-231 au fost crescute în plăci cu 96 de godeuri la o densitate celulară de aproximativ 1 x 105 celule/ml/godeu și au fost incubate timp de 12 ore la 37,0°C într-o atmosferă de 5% CO2 și 95% aer.RuDA și RuDA NP dizolvate în apă au fost adăugate la celule.După 12 ore de incubare, celulele au fost expuse la o radiație laser de 0,5 W cm -2 la o lungime de undă de 808 nm timp de 10 minute (300 J cm -2) și apoi incubate la întuneric timp de 24 de ore.Celulele au fost apoi incubate cu MTT (5 mg/ml) pentru încă 5 ore.În cele din urmă, schimbați mediul în DMSO (200 pl) pentru a dizolva cristalele de formazan violet rezultate.Valorile OD au fost măsurate folosind un cititor de microplăci cu o lungime de undă de 570/630 nm.Valoarea IC50 pentru fiecare probă a fost calculată utilizând software-ul SPSS din curbele doză-răspuns obținute din cel puțin trei experimente independente.
Celulele MDA-MB-231 au fost tratate cu RuDA și RuDA-NP la o concentrație de 50 μM.După 12 ore de incubare, celulele au fost iradiate cu un laser cu o lungime de undă de 808 nm și o putere de 0,5 W/cm2 timp de 10 min (300 J/cm2).În grupul cu vitamina C (Vc), celulele au fost tratate cu 0,5 mM Vc înainte de iradierea cu laser.Celulele au fost apoi incubate la întuneric timp de încă 24 de ore, apoi colorate cu calceină AM și iodură de propidiu (20 μg/ml, 5 μl) timp de 30 de minute, apoi spălate cu PBS (10 μl, pH 7,4).imagini cu celule colorate.
Ora postării: 23-sept-2022
