Știri

Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Celulele canceroase au dezvoltat diverse mecanisme pentru a depăși stresul celular și pentru a continua să progreseze.Protein kinaza R (PKR) și activatorul său proteic (PACT) sunt respondenții inițiali care monitorizează diferite semnale de stres care conduc la inhibarea proliferării celulare și a apoptozei.Cu toate acestea, reglarea căii PACT-PKR în celulele canceroase rămâne în mare parte necunoscută.Aici, am descoperit că ARN-ul lung necodant (lncRNA) aspartil tRNA sintetază ARN antisens 1 (DARS-AS1) este direct implicat în inhibarea căii PACT-PKR și promovează proliferarea celulelor canceroase.Folosind screeningul funcțional la scară largă a lncRNA asociat cancerului CRISPRi 971, am descoperit că DARS-AS1 a fost asociat cu o proliferare semnificativ îmbunătățită a celulelor canceroase.Prin urmare, knockout-ul DARS-AS1 inhibă proliferarea celulară și promovează apoptoza celulelor canceroase în diferite linii de celule canceroase in vitro și reduce semnificativ creșterea tumorii in vivo.Din punct de vedere mecanic, DARS-AS1 se leagă direct la domeniul de activare PACT și previne interacțiunea PACT-PKR, reducând astfel activarea PKR, fosforilarea eIF2α și inhibând moartea celulelor apoptotice.Din punct de vedere clinic, DARS-AS1 este exprimat pe scară largă în mai multe tipuri de cancer, iar supraexprimarea acestui lncARN indică un prognostic prost.Acest studiu elucidează reglarea specifică cancerului a căii PACT-PKR de către DARS-AS1 lncRNA și oferă o altă țintă pentru prognosticul și tratamentul cancerului.
Capacitatea de a se adapta la stres este o caracteristică importantă a supraviețuirii și proliferării celulelor canceroase.Proliferarea rapidă și semnele metabolice ale cancerului atinge vârful în micromedii dure - privarea de nutrienți, hipoxie și pH scăzut - care pot declanșa căile de semnalizare a morții celulare.Dereglarea genelor sensibile la stres, cum ar fi p535, proteinele de șoc termic 6, 7, KRAS8, 9 și HIF-110, 11, 12, 13 este observată frecvent în cancer, blocând astfel apoptoza și promovând supraviețuirea.
Protein kinaza R (PKR) este un important senzor de stres și subunitate kinaza a factorului de inițiere eucariotic 2α (eIF2α), un regulator translațional care leagă stresul celular de moartea celulei.PKR a fost inițial identificat ca o proteină antivirală prin detectarea unui ARN dublu catenar străin (dsRNA).La activare, PKR fosforilează eIF2α pentru a inhiba sinteza proteinelor virale și celulare14,15,16.PACT (proteina activatoare PKR) a fost identificată ca prima proteină activatoare PKR în absența dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Prin interacțiunea directă cu PKR, PACT transduce diferite tensiuni (înfometarea serului, tratarea cu peroxid sau arsenit) către PKR și căile de semnalizare din aval.Pe lângă fosforilarea eIF2α, activarea PKR mediată de PACT declanșează diverse evenimente asociate cu răspunsul la stres, inclusiv starea redox modificată prin calea PI3K/Akt24, verificarea îmbunătățită a daunelor ADN prin p5325,26 și NF-κB27,28 Reglează transcripția, 29. Având în vedere rolul lor critic în răspunsul la stres, proliferare, apoptoză și alte procese celulare cheie, PKR și PACT sunt ținte terapeutice promițătoare pentru multe boli, în special pentru cancer30,31,32,33.Cu toate acestea, în ciuda acestei semnificații funcționale și biologice pleiotrope, reglarea activității PACT/PKR în celulele canceroase rămâne evazivă.
LncRNA-urile sunt transcrieri mai mari de 200 de nucleotide fără potențial de codificare a proteinelor.Deoarece proiectele de ultimă oră de secvențiere a genomului întreg au identificat mii de lncRNA-uri, s-au depus mult efort pentru a elucida funcțiile lor biologice.Un număr tot mai mare de cercetări a arătat că lncRNA-urile sunt implicate în multe procese biologice37, inclusiv reglarea inactivării cromozomilor X38,39, imprimare40, transcripție41,42, translație43 și chiar creșterea cancerului44,45,46,47.Aceste studii au raportat că multe lncRNA sunt implicate în calea PACT/PKR.Un astfel de studiu a arătat că lncRNA ASPACT a inhibat transcripția PACT și a crescut retenția nucleară a ARNm PACT.Alte studii au arătat că lncRNA nc886 se leagă de PKR și inhibă fosforilarea acestuia49,50.Până acum, lncRNA care reglează activarea PKR mediată de PACT nu a fost raportată.
Aspartil-ARNt sintetaza ARN antisens 1 (DARS-AS1) a fost identificat ca un lncARN oncogen51,52,53,54.Prin reglarea miP-194-5p53, miP-12952 și miP-532-3p51, s-a demonstrat că DARS-AS1 promovează creșterea carcinomului renal cu celule clare, a carcinomului tiroidian și, respectiv, a carcinomului pulmonar fără celule mici.Tong și colegii au descoperit, de asemenea, că DARS-AS1 promovează progresia mielomului prin menținerea stabilității motivului de legare a ARN-ului proteinei 39 (RBM39).Cu toate acestea, nu au fost efectuate studii privind dacă acest lncARN este implicat în reglarea activării PACT-PKR și în răspunsul la stres al celulelor canceroase.
Aici, am efectuat un ecran de pierdere a funcției pe scară largă folosind sistemul CRISPRi și am stabilit că lncRNA DARS-AS1 promovează proliferarea mai multor tipuri de celule canceroase.În plus, am identificat un mecanism major: DARS-AS1 se leagă direct de PACT, inhibă legarea PACT și PKR, previne fosforilarea eIF2α, un substrat PKR inferior și, în cele din urmă, inhibă moartea celulelor apoptotice.În concluzie, munca noastră dezvăluie lncRNA DARS-AS1 ca un regulator al căii PACT-PKR și o țintă potențială pentru tratamentul și prognosticul cancerului.
Studii extinse de profilare genomică au identificat sute de lncRNA-uri asociate cu cancerul.Cu toate acestea, funcția lor rămâne în mare parte necunoscută56.Pentru a identifica candidații promițători de lncRNA implicați în progresia cancerului, am efectuat un screening de pierdere a funcției pentru reducerea proliferării în linia celulară de cancer colorectal SW620 folosind sistemul CRISPRi (Fig. 1a).Caracteristica unică a liniilor celulare de cancer de colon SW480 și SW620 este că acestea sunt derivate din tumori primare și secundare la un singur pacient.Aceasta oferă o comparație valoroasă pentru studiul modificărilor genetice în progresia cancerului de colon avansat.Prin urmare, am analizat transcriptoamele liniilor celulare de cancer colorectal (SW480 și SW620) folosind secvențierea ARN și am colectat unele lncRNA funcționale potențiale din literatura publicată.Pe baza acestor rezultate, am proiectat o bibliotecă sgRNA combinată care conține 7355 sgRNA oligos care vizează 971 lncRNA-uri asociate cancerului și 500 sgRNA oligos nețintiți pentru un control negativ (Date suplimentare 1).
Reprezentarea schematică a screening-ului folosind sistemul CRISPRi.b îmbogățirea sgRNA după screening.Linia punctată orizontală reprezintă log2 (schimbarea pliului) = ±0,58.Linia punctată verticală indică valoarea p = 0,05.Punctele negre reprezintă ARNsg non-țintă (desemnat ca NC).Punctele roșii sunt ARNsg care vizează DARS-AS1.Punctele albastre sunt ARNsg care vizează LINC00205, un lncARN oncogen descris anterior.fold change = (citire normalizată, ziua 17)/(cititură normalizată, ziua 0).c Knockdown-ul sgRNA DARS-AS1 a inhibat creșterea celulelor.Barele de eroare reprezintă ± abaterea standard a celor trei experimente.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 Testul t Student cu două cozi.d Expresia DARS-AS1 în tumori (set de date TCGA).em Expresia DARS-AS1 în probe normale și tumorale pereche de la pacienți cu BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP și, respectiv, COAD (set de date TCGA).Valorile p au fost obținute folosind testul t Student cu două cozi perechi.
După construirea plasmidei și ambalarea lentivirusului, am transdus linia celulară de cancer colorectal dCas9-SW620 cu biblioteca de mai sus în patru experimente independente de infecție.Multiplicitatea infecției (MOI) pentru aceste infecții a fost de 0,1-0,3, ceea ce indică faptul că fiecare celulă poate fi transfectată doar cu un sgARN.După 18 zile de cultură in vitro, profilul de îmbogățire al ARNsg-țintă a scăzut sau a crescut după screening, în timp ce numărul de oligonucleotide de control nețintite a rămas relativ neschimbat în comparație cu profilul de pre-screening, ceea ce indică faptul că ținta noastră are o specificitate foarte mare pentru screening. bibliotecă.Orez.1b și tabelul suplimentar 1). LINC00205, care a fost raportat anterior că promovează cancerul pulmonar și progresia cancerului hepatic58,59,60, a fost eliminat (log2 (modificare) <-0,58, valoarea p <0,05), confirmând fiabilitatea acestui screening (Fig. 1b). LINC00205, care a fost raportat anterior că promovează cancerul pulmonar și progresia cancerului hepatic58,59,60, a fost eliminat (log2 (modificare) <-0,58, valoarea p <0,05), confirmând fiabilitatea acestui screening (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, raportat anterior că promovează progresia cancerului pulmonar și a cancerului hepatic58,59,60, a fost exclus (log2 (modificare ori) <-0,58, valoarea p <0,05), confirmând robustețea acestui screening (Fig. .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, raportat anterior că promovează progresia cancerului pulmonar și hepatic58,59,60, a fost exclus (log2 (modificare ori) <-0,58, valoarea p <0,05), confirmând robustețea acestui screening (Fig. .1b).
Printre toate lncRNA-urile testate, DARS-AS1 a fost, de asemenea, testat, cu cele trei oligonucleotide sgRNA înrudite reduse semnificativ după 18 zile de cultură, ceea ce sugerează că distrugerea acestui lncARN a dus la reducerea proliferării cancerului (Fig. 1b).Acest rezultat a fost susținut în continuare de analiza MTS în celulele cancerului colorectal, arătând că rata de creștere a celulelor knockdown DARS-AS1 a fost doar la jumătate în comparație cu celulele de control (Figura 1c) și a fost în concordanță cu rapoartele anterioare ale mai multor alte tipuri de cancer.: cancer renal cu celule clare, cancer tiroidian și cancer pulmonar fără celule mici51,52,53,55.Cu toate acestea, funcția și mecanismele moleculare ale cancerului colorectal rămân neexplorate.Prin urmare, am ales acest lncARN pentru studii suplimentare.
Pentru a studia expresia DARS-AS1 la pacienți, am analizat cuprinzător 10.327 de mostre de tumoră din proiectul Cancer Genome Atlas (TCGA).Rezultatele noastre arată că DARS-AS1 este exprimat pe scară largă și reglat în mod semnificativ în celulele sănătoase într-o varietate de tumori, inclusiv adenocarcinomul de colon (COAD), carcinomul cu celule clare renale (KIRC) și carcinomul cu celule papilare renale (KIRP)..Foarte puține (Fig. 1d și Fig. 1a, b suplimentară). Analiza probelor pereche sănătoase/tumorale a confirmat în continuare o expresie semnificativ mai mare a DARS-AS1 în tumorile carcinomului urotelial al vezicii urinare (BLCA), carcinomului cu celule clare renale (KIRC), adenocarcinomului de prostată (PRAD), carcinomului cu celule scuamoase pulmonare (LUSC) , carcinom endometrial al corpului uterin (UCEC), adenocarcinom pulmonar (LUAD), carcinom hepatocelular hepatic (LIHC), carcinom cu celule papilare renale renale (KIRP) și adenocarcinom de colon (COAD) (valoarea p < 0,05) (Fig. 1e-m) . Analiza probelor pereche sănătoase/tumorale a confirmat în continuare o expresie semnificativ mai mare a DARS-AS1 în tumorile carcinomului urotelial al vezicii urinare (BLCA), carcinomului cu celule clare renale (KIRC), adenocarcinomului de prostată (PRAD), carcinomului cu celule scuamoase pulmonare (LUSC) , carcinom endometrial al corpului uterin (UCEC), adenocarcinom pulmonar (LUAD), carcinom hepatocelular hepatic (LIHC), carcinom cu celule papilare renale renale (KIRP) și adenocarcinom de colon (COAD) (valoarea p < 0,05) (Fig. 1e-m) .Analiza probelor pereche sănătoase/tumorale a confirmat, de asemenea, o expresie semnificativ mai mare a DARS-AS1 în carcinomul urotelial al vezicii urinare (BLCA), carcinomul cu celule clare renale și renale (KIRC), adenocarcinomul de prostată (PRAD), carcinomul cu celule scuamoase pulmonare (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , carcinom endometrial al corpului uterin (UCEC), adenocarcinom pulmonar (LUAD), carcinom hepatocelular al ficatului (LIHC), carcinom cu celule papilare al rinichiului (KIRP) și adenocarcinom de colon (COAD) (valoarea p < 0,05) (Fig. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的 的 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （UCEC） ， 肺腺癌 （LUAD） ， 肝肝 细胞癌 （LIHC） ， 肾 肾 乳头状 细胞癌 （KIRP） 和结肠腺癌 （CoAd） （P 值<0,05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 了 dARS-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 肾 乳头状 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Analiza probelor pereche sănătoase/tumorale a susținut în continuare rolul DARS-AS1 în carcinomul urotelial vezicii urinare (BLCA), carcinomul cu celule renale cu celule clare (KIRC), adenocarcinomul de prostată (PRAD) și carcinomul cu celule scuamoase pulmonare (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). expresie în carcinomul corpus uterin (UCEC), adenocarcinomul pulmonar (LUAD), carcinomul hepatocelular (LIHC), carcinomul cu celule papilare renale (KIRP) și adenocarcinomul de colon (COAD) (valoarea p <0,05) (Figura 1e -m).Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că DARS-AS1 este exprimat pe scară largă și puternic într-o varietate de tipuri de cancer.
Deoarece DARS-AS1 și DARS (gena care codifică catena antisens) au același promotor și sunt situate unul lângă celălalt, am proiectat shRNA pentru a distruge în mod specific DARS-AS1, dar nu și DARS (Figura suplimentară 2a, b și Tabelul suplimentar 2) .În plus față de SW620, am folosit și alte trei linii celulare care exprimă înalt DARS-AS1 pentru a studia eficacitatea și funcția knockdown shRNA (Tabelul suplimentar 3).Rezultatele noastre au indicat că toate cele trei shRNA-uri dezvoltate au atins o eficiență de deprimare a DARS-AS1 de cel puțin 80% cu un efect redus asupra cantității de ARNm DARS (Figura suplimentară 2c-f).În plus, am constatat că distrugerea DARS-AS1 cu aceste shRNA a inhibat semnificativ creșterea celulelor în liniile celulare de cancer colorectal SW620 (49,7%) și HCT116 (27,7%), linia celulară de cancer de sân MBA-MD-231 (53,4%).) și linia celulară de hepatom HepG2 (reducere de 92,7%), precum și capacitatea acestora de a forma sfere neancorate (reducere medie de ~ 50,8%, 44,6%, 40,7% și 75,7% per linie celulară) (Fig. 2a,b).În SW620, rezultatele testului de formare a coloniilor au confirmat în continuare că shRNA DARS-AS1 a inhibat semnificativ proliferarea celulară cu o scădere medie de aproximativ 69,6% (Fig. 2c).
Efectul shRNA de control și DARS-AS1 shRNA asupra proliferării celulare (a) și formării sferoidelor (b) în celulele SW620, HCT116, MBA-MD-231 și HepG2.c Efectul shRNA de control și DARS-AS1 shRNA asupra formării coloniilor în celulele SW620.Proliferarea celulară (d), formarea de sferoizi (e) și formarea de colonii (f) de celule SW620 care supraexprimă DARS-AS1.Datele prezentate sunt media ± abaterea standard a trei experimente.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 și *** p ≤ 0,001 prin testul t Student cu două cozi.
Pentru a completa studiile de pierdere a funcției, am creat apoi celule SW620 care supraexprimă DARS-AS1 (Fig. 2g suplimentară).Supraexpresia DARS-AS1 a crescut semnificativ creșterea celulelor (de 1,8 ori), formarea de sferoizi neancorați (de 1,4 ori) și formarea de colonii (3,3 ori) în celulele SW620 (Fig. 2d-f).Am confirmat acest rezultat folosind o altă linie celulară care exprimă DARS-AS1, A549.Această proliferare celulară îmbunătățită datorită supraexprimării DARS-AS1 a fost observată în continuare în celulele A549 (Figura suplimentară 2h, i și Tabelul suplimentar 3).Luate împreună, aceste studii de câștig și pierdere demonstrează că DARS-AS1 promovează proliferarea celulelor canceroase in vitro.
Pentru a explora mecanismul de bază prin care DARS-AS1 reglează proliferarea celulară, am efectuat o analiză ARN pull-down pentru a identifica potențialii săi parteneri de legare a proteinelor.Rezultatele RT-qPCR au arătat că aproximativ 86,2% din DARS-AS1 este localizat în citoplasma celulelor SW620 (Fig. 3a suplimentară).DARS-AS1 sau pseudoARN biotinilat transcris in vitro a fost apoi incubat cu lizate de celule SW620 urmate de separarea SDS-PAGE.Colorarea ulterioară cu argint a arătat că o bandă distinctă (~ 38 kDa) a fost îmbogățită în mod semnificativ în probele de trage DARS-AS1, dar nu și în probele de ARN sau mărgele false (Fig. 3a).Această bandă a fost identificată ca o proteină de activare a PKR (PACT) prin spectrometrie de masă (MS) și confirmată în continuare prin imunoblot în liniile celulare SW620, HCT116 și HepG2 (Fig. 3a, b).Îmbogățirea DARS și a proteinelor PACT înrudite - PKR și TRBP - a fost de asemenea investigată folosind analiza ARN prin Western blot (WB).Rezultatele au indicat că nu a fost găsită nicio interacțiune directă între ARN-ul DARS-AS1 și aceste trei proteine ​​(Fig. 3b suplimentară).Interacțiunea specifică dintre DARS-AS1 și PACT a fost confirmată în continuare prin analiza imunoprecipitării ARN (RIP), care a arătat că DARS-AS1 a fost îmbogățit semnificativ în anticorpi anti-PACT, dar nu și în alți ARN de control (Figura 3c).Pentru a determina dacă DARS-AS1 interacționează direct cu PACT în absența oricăror alte componente celulare, s-a efectuat un test de interferometrie in vitro (BLI) folosind PACT purificat.DARS-AS1 sau ARN inactiv marcat cu biotină a fost imobilizat pe biosenzori de streptavidină (SA) și apoi incubat în tampon cinetic care conține 1 μM PACT.În special, PACT s-a legat puternic de DARS-AS1 (valoarea KD ~ 26,9 nM), dar nu pentru a imita ARN-ul (Figura 3d).Luate împreună, aceste rezultate demonstrează o interacțiune directă și o afinitate ridicată între DARS-AS1 și PACT.
Analiza de tragere ARN a identificat DARS-AS1 care interacționează cu PACT în celulele SW620.Mai sus, colorarea cu argint a proteinelor înrudite.Imunobloturile inferioare au fost efectuate cu anticorp anti-PACT.b Analiza ARN pull-down a fost efectuată în celulele HCT116 (sus) și HepG2 (jos).Îmbogățirea PACT a fost detectată prin imunoblot.Testele de imunoprecipitare a cARN (RIP) au fost efectuate în celule SW620 utilizând anticorpii indicați.d Curbele de legare PACT la DARS-AS1 de lungime întreagă sau ARN-ul de control au fost obținute utilizând interferometria biostrat (BLI).ARN-ul a fost imobilizat pe un biosenzor de streptavidină.1 μM PACT a fost folosit pentru a măsura asocierea.Analiza de tragere a ARN a fost efectuată folosind DARS-AS1 de lungime completă biotinilat sau trunchiat (sus).Imunoblot care arată PACT primit (jos).f PACT marcat purificat a fost incubat cu DARS-AS1 de lungime completă biotinilat sau trunchiat (ca în e) pentru testul RIP in vitro.ARN-ul extras a fost verificat prin RT-qPCR.g Afinitatea relativă a diferitelor fragmente de ARN pentru PACT a fost obținută utilizând interferometrie pe biostrat.Pentru analiză, s-au folosit 100 nM ARN și 1 μM RAST.h Testele RIP in vitro au fost efectuate utilizând PACT purificat intact sau trunchiat etichetat.ARN-ul extras a fost verificat prin RT-qPCR.i Rata de creștere a celulelor SW620 care supraexprimă DARS-AS1, PACT sau ambele.j Supraexprimarea DARS-AS1 de lungime completă sau trunchiată în celulele SW620 a avut efecte diferite asupra creșterii celulelor.k Apoptoza a fost detectată prin imunoblotting cu anticorp anti-PARP.l Knockout-ul DARS-AS1 induce apoptoza celulelor SW620, așa cum se arată prin citometria în flux.Datele prezentate sunt media ± abaterea standard a trei experimente. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, prin testul t Student cu două cozi. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, prin testul t Student cu două cozi. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 prin testul t Student cu două cozi. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 prin testul t Student cu două cozi.
Apoi am generat trei fragmente de ARN DARS-AS1 biotinilate prin transcripție in vitro pentru a identifica regiunea DARS-AS1 necesară pentru asocierea PACT (Figura 3e).Rezultatele analizei ARN au arătat că fiecare fragment a fost capabil să interacționeze cu PACT, dar regiunea 3′-terminală (384–768 nucleotide marcate A3) a arătat mai mult de 1–384 nucleotide marcate A1) (Fig. 3e).Rezultate similare au fost observate în testul RIP in vitro folosind PACT recombinant (Figura 3f).În concordanță cu aceste rezultate, experimentele de legare a fragmentelor de ARN imobilizate la PACT folosind BLI au arătat, de asemenea, că PACT are o afinitate mai mare pentru A3 (384–768 nt) (valoarea KD de aproximativ 94,6 nM), în timp ce aproape nicio legătură cu alte zone.(Fig. 3d).
Am examinat, de asemenea, regiunile de legare asociate în PACT.PACT conține trei domenii funcționale, dintre care două sunt domenii conservate de legare a ARN-ului dublu catenar (dsRBD) și un al treilea domeniu (denumit D3) care acționează ca un activator al interacțiunilor proteinelor.Pentru a examina capacitatea de legare a lncRNA a fiecărui domeniu, am proiectat trei mutații care au eliminat fiecare dintre cele trei domenii și am efectuat un test RIP in vitro.Rezultatele noastre au arătat că ștergerea celui de-al treilea domeniu (D3) al PACT a redus semnificativ interacțiunea cu DARS-AS1 (de 0,11 ori în comparație cu PACT intact) în comparație cu celelalte două mutații (Fig. 3h), s-a arătat că eliberarea din D3 a interacționat cu DARS.-AC1.Luate împreună, aceste rezultate sugerează că interacțiunea dintre DARS-AS1 și PACT poate avea loc în principal prin capătul 3′ al DARS-AS1 și domeniul D3 al PACT.
Am observat că DARS-AS1 nu a avut niciun efect asupra expresiei PACT și PACT nu a avut niciun efect asupra DARS-AS1 (Figura suplimentară 3c).Apoi am examinat efectul depășirii PACT asupra creșterii celulelor.Spre deosebire de DARS-AS1, celulele relative au crescut de 1,5-3 ori mai repede atunci când PACT a fost doborât (Fig. 3d suplimentară).Rezultatele testului de formare a coloniilor au indicat că celulele au format colonii de 2-3 ori după tratamentul shRNA cu PACT (Figura suplimentară 3e).Pentru a testa dacă DARS-AS1 reglează proliferarea celulară prin PACT, am generat celule SW620 care supraexprimă PACT, DARS-AS1 sau ambele.Supraexprimarea PACT a arătat o inhibare semnificativă a proliferării celulare (Figura 3i).În timp ce supraexprimarea DARS-AS1 per se a promovat în mod semnificativ proliferarea celulară, nu a existat nicio diferență semnificativă în rata de creștere a celulelor care supraexprimă DARS-AS1 și PACT.Aceste rezultate sugerează că PACT poate contracara proliferarea crescută cauzată de supraexprimarea DARS-AS1.
Deoarece diferite regiuni ale DARS-AS1 au abilități diferite de legare a PACT, am investigat influența lor relativă asupra proliferării celulare prin supraexpresie diferită a fragmentelor DARS-AS1.În comparație cu celelalte două fragmente, DARS-AS1 a fost supraexprimat la capătul 3′ (384–768 nt), principala regiune legată de PACT din DARS-AS1, care a avut cea mai mare capacitate de a stimula proliferarea celulară (Fig. 3j).Aceste rezultate indică o corelație pozitivă între capacitatea de legare și funcția biologică a DARS-AS1.
S-a raportat că PACT este o proteină pro-apoptotică19.Prin urmare, am investigat efectul DARS-AS1 asupra apoptozei.După cum era de așteptat, declanșarea DARS-AS1 a crescut semnificativ clivajul PARP în celulele SW620 și a crescut proporția de celule pozitive anexinei V în liniile celulare SW620, HCT116, HepG2 și MBA-MD-231 (Fig. 3k).3).3f-h), indicând faptul că efectul anti-apoptotic al DARS-AS1 în celulele canceroase este opus funcției de inducere a apoptozei a PACT.Luate împreună, aceste rezultate sugerează că mecanismul funcției oncogene DARS-AS1 poate fi prin inhibarea funcției PACT.
În continuare, am explorat implicațiile funcționale ale asocierii DARS-AS1-PACT.S-a raportat că PACT activează PKR prin interacțiune directă, care ulterior îmbunătățește fosforilarea eIF2α, provocând ștergerea translațională și apoptoza17.În primul rând, am examinat dacă DARS-AS1 afectează localizarea celulară a PACT și PKR.Microscopia cu fluorescență confocală a arătat că PACT și PKR au fost foarte colocalizate în celulele SW620 cu un coeficient mediu de corelație Pearson de 0,72.Între timp, supraexpresia DARS-AS1 a redus semnificativ co-localizarea PACT și PKR (coeficientul mediu de corelație Pearson 0,61) (Figura 4a).Pentru a investiga dacă DARS-AS1 ar putea modula interacțiunea PACT-PKR, am efectuat un test de co-imunoprecipitare (co-IP) cu anticorp anti-PACT în lizate de celule SW620.PKR a fost foarte îmbogățit în anti-PACT în celulele de control, în timp ce recuperarea PKR a fost redusă semnificativ în lizatele din celulele care supraexprimă DARS-AS1 (Fig. 4b).PACT și PKR purificate marcate au fost utilizate pentru testele in vitro de legare la proteine.În consecință, cei care au furnizat DARS-AS1, dar niciun ARN de control au prezentat interacțiune PACT-PKR suprimată (Figura 4c).Toate rezultatele au arătat că DARS-AS1 a perturbat comunicarea PACT și PKR.
a fost observată o co-localizare a PACT și PKR în celulele de control sau celulele care supraexprimă DARS-AS1 utilizând microscopia confocală de fluorescență.Nucleele au fost colorate cu DAPI.Rezultatele statistice au fost obținute din 16 fotografii.b Co-imunoprecipitare (co-IP) folosind anticorpi anti-PACT în lizate de celule ale celulelor SW620 martor sau celule care supraexprimă DARS-AS1.c PACT marcat, PKR purificat și transcris in vitro cu DARS-AS1 sau ARN simulat au fost incubate pentru analiza in vitro de legare la proteine.Anticorpii anti-flag au fost utilizați pentru imunoprecipitare.d Imunobloturile cu anticorpii indicați au fost efectuate în celule SW620 și HCT116 transfectate cu shARN de control sau DARS-AS1-shARN urmate de inaniție de ser.Nivelurile de expresie DARS-AS1 au modificat sensibilitatea celulară la thapsigargin.Celulele SW620 au fost transfectate cu ARNsh DARS-AS1, plasmidă de supraexpresie DARS-AS1 sau plasmidă de control.Celulele au fost tratate cu thapsigargin timp de 48 de ore și viabilitatea celulară a fost determinată folosind reactivul MTS.f DARS-AS1 transcris in vitro sau ARN inactiv și PACT purificat au fost utilizate pentru testul de activare in vitro și detectarea imunoblot.g Imunobloturi folosind acești anticorpi au fost efectuate pe celule SW620-ctrl (stânga) sau celule care supraexprimă mutanți PKR (dreapta).Aceste celule au fost apoi transfectate cu shARN de control sau DARS-AS1-shARN urmat de înfometarea serului.h Citometria în flux a arătat că inactivarea PKR mutantă a compensat apoptoza indusă de DARS-AS1 în celulele SW620.i S-au efectuat imunobloturi cu anticorpii indicați în celulele SW620 (stânga) sau HCT116 (dreapta).Celulele transfectate cu shARN de control sau shARN DARS-AS1 sunt private de ser și suplimentate cu 100 nM inhibitor PKR C16 sau DMSO.Bară de scară = 5 µm.Datele prezentate sunt media ± abaterea standard a trei experimente.* p ≤ 0,05 testul t Student cu două cozi.
În general, se crede că odată ce PACT interacționează cu PKR17, fosforilarea PKR la Thr451 poate fi indusă.Rezultatele noastre au indicat că nivelul de fosforilare a PKR a fost semnificativ crescut în celulele knockdown DARS-AS1 după înfometarea serului (Fig. 4d și Fig. 4a suplimentară).În consecință, am constatat că fosforilarea eIF2α, principalul substrat PKR, a fost, de asemenea, crescută semnificativ de shRNA DARS-AS1 (Fig. 4d și Fig. 4a suplimentară).Thapsigargin este un factor de stres ER care determină ER să elibereze Ca2+.S-a raportat că tratamentul cu thapsigargin induce expresia și activarea PACT, care interacționează și activează în continuare PKR, ducând la apoptoză prin creșterea fosforilării eIF2α 18,61.Aici, am folosit thapsigargin ca stimulator al căii PACT/PKR pentru a investiga dacă DARS-AS1 poate ajuta celulele să depășească stresul prin inhibarea căii PACT/PKR.Am observat că nivelul expresiei DARS-AS1 a corelat pozitiv cu rezistența celulelor la thapsigargin.Celulele SW620 care supraexprimă DARS-AS1 au supraviețuit mai bine atunci când au fost tratate cu thapsigargin, în timp ce celulele cu cădere DARS-AS1 au devenit mai susceptibile (Fig. 4e).În concordanță cu aceste rezultate, supraexpresia DARS-AS1 a redus fosforilarea PKR indusă de thapsigargin (Fig. 4b suplimentară).Spre deosebire de aceasta, după tratamentul cu thapsigargin, PKR și eIF2α au fost fosforilate într-o măsură mai mare în celulele knockdown DARS-AS1 comparativ cu celulele de control (Figura suplimentară 4b).Interesant, thapsigargin a indus expresia DARS-AS1 într-o manieră dependentă de doză, ceea ce poate indica o funcție antistres a DARS-AS1 (Figura suplimentară 4c).În plus, am efectuat teste de activare in vitro pentru a confirma aceste observații.Pe scurt, PKR a fost purificat din lizate de celule folosind un anticorp anti-PKR, apoi incubat cu PACT recombinant și DARS-AS1 transcris in vitro.După reacția enzimatică, fosfo-PKR a fost detectat folosind WB.Rezultatele noastre au indicat că fosforilarea PKR a fost inhibată semnificativ de DARS-AS1, dar nu de ARN-ul de control (Figura 4f).Aceste rezultate in vitro și in vivo sugerează că DARS-AS1 inhibă activarea PKR mediată de PACT.În același timp, am observat și o scădere a recuperării PACT în prezența DARS-AS1 (Figura 4f).Acest rezultat este în concordanță cu rezultatele testului de legare a proteinei in vitro (Figura 4c) și ilustrează din nou funcția de blocare a DARS-AS1 pentru asocierea PACT-PKR.
Ser246 și Ser287 din domeniul D3 al PACT sunt necesare pentru activarea PKR sub stres celular.Înlocuirea a două resturi de serină cu alanină a dat PACT mutant (mutD), care a activat PKR în absența stresului, iar înlocuirea alaninei (mutA) a inversat protocolul.Deoarece am demonstrat importanța acestui domeniu în asociere directă cu DARS-AS1, am generat acești doi mutanți PACT pentru a testa dacă aceste reziduuri ar putea fi implicate și în interacțiunea cu DARS-AS1.Interesant, ambii mutanți și-au pierdut capacitatea de a se lega de DARS-AS1 (Figura suplimentară 4d), sugerând că structura completă a proteinei PACT poate fi necesară pentru o interacțiune eficientă cu DARS-AS1.
În plus, rezultatele noastre sugerează, de asemenea, că inhibarea proliferării celulare indusă de DARS-AS1-shRNA poate fi restabilită parțial prin supraexprimarea unui mutant PACT negativ dominant (PACTmutA) sau a unui mutant PKR negativ dominant (PKRmut) (Figura suplimentară 4e. e).Supraexprimarea mutanților PKR dominant-negativi a redus fosforilarea PKR indusă de distrugerea DARS-AS1, precum și fosforilarea eIF2α în celulele private de ser (Fig. 4g).Mai important, proporția de celule apoptotice induse de distrugerea DARS-AS1 a fost, de asemenea, redusă în celulele care supraexprimă PKRmut (Fig. 4h și Fig. 4g suplimentară).Inhibarea activității PKR kinazei afectează, de asemenea, funcția DARS-AS1, deoarece rezultatele au arătat că declanșarea DARS-AS1 a declanșat rar fosforilarea PKR și eIF2α atunci când celulele au fost tratate cu un inhibitor C16 specific PKR (Fig. 4i și Fig. 4h suplimentară).).Luate împreună, rezultatele noastre sugerează că DARS-AS1 promovează proliferarea celulară, cel puțin parțial, prin inhibarea activării PKR mediată de PACT.
Pentru a explora în continuare rolul DARS-AS1 în tumorigeneză, am efectuat experimente in vivo folosind un model de xenogrefă de șoarece. Rezultatele arată că distrugerea DARS-AS1 a scăzut dramatic creșterea tumorii la șoareci (valoarea p < 0,0001) (Fig. 5a). Rezultatele arată că distrugerea DARS-AS1 a scăzut dramatic creșterea tumorii la șoareci (valoarea p < 0,0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (знашей) (значе,ние 0.15) Rezultatele arată că distrugerea DARS-AS1 reduce drastic creșterea tumorii la șoareci (valoarea p < 0,0001) (Figura 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значительно снижает рост опухоли у мышей) (значительно снижает). Rezultatele au arătat că declanșarea DARS-AS1 a redus semnificativ creșterea tumorii la șoareci (valoarea p < 0,0001) (Figura 5a).Astfel, în grupul de deprimare DARS-AS1, a existat o scădere semnificativă a volumului mediu al tumorii cu aproximativ 72,9% și a masei medii a tumorii cu aproximativ 87,8% (Figura 5b-d).Aceste rezultate sugerează cu tărie că DARS-AS1 poate promova în mod semnificativ creșterea tumorii in vivo.
Efectele declanșării ad DARS-AS1 asupra oncogenezei colorectale la șoarecii nuzi.Sunt prezentate curbele de creștere (a), dimensiunea tumorii (b), greutatea (c) și imaginile tumorii (d).Barele de eroare reprezintă ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, prin testul t Student cu două cozi. n = 10. ****p < 0,0001, prin testul t Student cu două cozi. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 Testul t Student cu două cozi.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 testul t Student cu două cozi.Kaplan-Meier a analizat corelația dintre nivelurile de expresie DARS-AS1 și supraviețuirea globală la pacienții cu UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM și LGG.Nivelurile ridicate ale expresiei DARS-AS1 la pacienți au fost în top 50%;nivelul scăzut al expresiei DARS-AS1 la pacienți a fost în 50%.Valorile p au fost determinate folosind testul de rang de log.f Model propus în care DARS-AS1 reglează calea PACT-PKR și creșterea tumorii.
Pentru a înțelege mai bine impactul clinic al DARS-AS1, am examinat corelația dintre expresia acestuia și supraviețuirea pacientului.Analizând setul de date TCGA, am descoperit că o expresie mai mare a DARS-AS1 a fost asociată cu melanomul uveal (UVM), cromofobia renală (KICH), carcinomul cu celule papilare renale (KIRP), mezoteliomul (MESO), multiplex.Supraviețuirea mai scăzută a fost asociată semnificativ cu morfoza glioblastomului (GBM) și pacienții cu gliom cerebral de grad scăzut (LGG) (Figura 5e).Aceste rezultate sugerează că DARS-AS1 poate juca un rol important în progresia clinică a tumorii și poate fi un potențial biomarker predictiv în mai multe tipuri de cancer.
În acest studiu, folosind screening-ul funcțional CRISPRi la scară largă, am stabilit că lncRNA DARS-AS1 depășește stresul celulelor canceroase prin reglarea a doi respondenți cheie la stres, PACT și PKR.Prin interacțiunea directă cu PACT, DARS-AS1 a inhibat activarea PKR mediată de PACT, prevenind astfel moartea celulelor apoptotice și promovând proliferarea celulară (Fig. 5f).Supreglarea DARS-AS1 a fost observată în mai multe tipuri de cancer, ceea ce sugerează că funcția sa de a promova supraviețuirea celulelor canceroase în condiții stresante poate fi aplicabilă pe scară largă pentru mai multe tipuri de cancer.
PACT a fost identificat ca o proteină activatoare PKR, iar activarea PKR mediată de PACT joacă un rol important în răspunsurile la stres prin reglarea transcripției, translației, apoptozei și a altor procese celulare importante62.De zeci de ani, s-au făcut încercări de a înțelege reglarea specifică cancerului a cascadei PACT-PKR.Aici, studiul nostru a dezvăluit un mecanism diferit de reglare a PACT-PKR în celulele canceroase prin lncRNA celular DARS-AS1, care se leagă direct de PACT, blochează interacțiunea PACT-PKR, inhibă activarea PKR și fosforilarea eIF2α, inhibând astfel apoptoza indusă de stres și stimulând eventuala proliferare a cancerului.celule.Această descoperire pune în lumină potențialele ținte lncRNA pentru prognosticul și terapia cancerului.
Datele noastre au arătat că declanșarea DARS-AS1 sensibilizează celulele la înfometarea serului cu o creștere semnificativă a PKR fosforilat și a eIF2α.Aceste rezultate sugerează că DARS-AS1 promovează supraviețuirea celulelor canceroase în condiții dure prin inhibarea activității PACT/PKR.Câteva alte ARN-uri necodificatoare, cum ar fi ASPACT și nc886, sunt, de asemenea, implicate în axa PACT/PKR prin reglarea în jos a ARNm PACT48 sau prin reglarea autofosforilării prin legarea la PKR49,50,64.Printre acestea, DARS-AS1 acționează ca un perturbator al asociației PACT-PKR.Acest studiu ne îmbogățește înțelegerea reglării axei PACT/PKR și a rolului lncRNA-urilor în răspunsurile la stres.
PACT conține trei domenii separate.Fiecare dintre primele două dsRBD este suficientă pentru a obține legarea cu afinitate mare a PACT la PKR, în timp ce al treilea domeniu (D3) este necesar pentru activarea PKR in vitro și in vivo.Studiul nostru a arătat că DARS-AS1 interacționează de preferință cu domeniul D3 (Fig. 3h).Având în vedere dimensiunea mare a lncRNA (768 nucleotide), legarea DARS-AS1 la D3 poate inhiba fizic interacțiunea dintre domeniul PACT al dsRBD și PKR, blocând astfel asocierea PACT și PKR.Mutațiile punctiforme PACT care au înlocuit Ser246 și Ser287 în D3 cu alanină sau aspartat i-au perturbat afinitatea de legare pentru DARS-AS1, indicând importanța proprietăților structurale și electrice generale ale D3 în asocierea lor.Mai multe detalii despre acest mecanism vor fi necesare în viitor, folosind analize biochimice mai precise și analize structurale PACT de înaltă rezoluție.
Studiile anterioare au raportat că DARS-AS1 promovează proliferarea celulară prin mai multe mecanisme51,52,53.Într-un exemplu, anchetatorii au observat că DARS-AS1 și-a reglat gena DARS care codifică proteina antisens prin țintirea miP-194-5p în celulele canceroase de rinichi.Cu toate acestea, în studiul de față, distrugerea DARS-AS1 a avut un efect redus asupra transcripției DARS în mai multe tipuri de cancer, inclusiv cel puțin cancerul colorectal, de sân și de ficat.Deoarece lncRNA-urile prezintă modele de expresie specifice celulelor și țesutului, este posibil ca mecanismele funcționale să nu fie conservate între tipurile de cancer, ceea ce poate contribui la această discrepanță între observațiile noastre și evaluările anterioare ale diferitelor tipuri de cancer.Sunt necesare studii speciale pentru a elucida mecanismele specifice ale diferitelor procese fiziologice și patologice.
O analiză a datelor clinice a arătat că expresia DARS-AS1 în tumori este invers corelată cu supraviețuirea pacienților cu cancer, ceea ce subliniază importanța axei DARS-AS1/PACT/PKR în prognosticul cancerului.În concluzie, studiul nostru arată că DARS-AS1 este un regulator al axei de semnalizare PACT/PKR, promovează proliferarea celulelor canceroase și inhibă apoptoza în timpul răspunsului la stres, ceea ce oferă o altă linie de cercetare și este de interes pentru cercetările viitoare în potențiale tratamente. .
Liniile celulare umane SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 și HEK293T au fost obținute de la Infrastructura națională de resurse a liniei celulare din China.Toate celulele au fost menținute în mediu DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) suplimentat cu 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) și 1% penicilină-streptomicina (Thermo Fisher Scientific) la 37°C, 5% CO2.incubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2a, Abcam (A0764));anti-eIF2a (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-p-tubulină, CST (2128);IgG normală de şoarece, CST (5415S);IgG normală de iepure, CST (2729S).Anticorpii au fost diluați 1:1000 în PBST pentru Western blot și 1:100 pentru IP.
sgRNA-urile au fost dezvoltate folosind un instrument disponibil public numit CRISPR-ERA66.Am folosit parametrii impliciti ai instrumentului pentru dezvoltarea sgRNA și algoritmul a calculat site-urile de legare a sgRNA în regiunea de 3 kb.centrat pe TSS.Pool-uri de oligonucleotide sgRNA au fost sintetizate la CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) și donate în plasmide pgRNA umanizate (Addgene #44248).Un total de 12 ug de plasmidă pgRNA umanizată reunită, 7,2 ug de psPAX2 (Addgene #12260) și 4,8 ug de pMD2.G (Addgene #12259) au fost co-transfectate în 5 x 106 HEK293T în reactiv de transfecție ADN de 10 cm. celule (CWBIO, Beijing, China) urmând instrucțiunile producătorului.Supernatanții care conțin virus au fost colectați la 48 și 72 de ore după transfecție și filtrați printr-un filtru de 0,45 um.Pentru screening, celulele SW620 care exprimă proteina de fuziune dCas9/KRAB au fost obținute prin transducția virusului.Celulele SW620 modificate au fost infectate cu biblioteca de virusuri în patru experimente independente de infecție la un MOI de 0,1-0,3 și au fost prelevate cu 2 μg/ml puromicină (Sigma, St. Louis, MO) timp de 2 zile.După aceea, celulele au fost cultivate timp de 18 zile in vitro cu o acoperire minimă a bibliotecii de 500 celule/sgARN pentru screening.
ADN-ul genomic a fost extras conform instrucțiunilor QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germania; 51183).În total, 100 μg de ADN genomic per repetare biologică au fost folosite pentru a construi biblioteca.Regiunea sgRNA a fost amplificată de două runde de PCR și legată de un cod de bare.
Produsele PCR au fost purificate folosind gel NucleoSpin® și kit de purificare PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germania; 740609.250) și cuantificate folosind kit-ul de detecție ADN dublu catenar Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Testul MTS a fost utilizat pentru a măsura proliferarea celulară.Celulele au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la o densitate inițială de 2000 celule/godeu.Numărul relativ de celule a fost măsurat zilnic la ora indicată pentru un total de 4-6 zile.Pentru fiecare godeu, 20 μl de reactiv MTS (Promega) au fost diluați cu 100 μl de DMEM, incubați cu celule timp de 4 ore la 37°C și apoi s-a măsurat OD490.
Capacitatea de creștere neancorată a fost descoperită prin analiza formării sferelor.Pe scurt, 2000 de celule transfectate cu shARN DARS-AS1 sau control shRNA au fost cultivate în microplăci cu atașare ultra scăzută (Corning) cu schimbarea mediului la fiecare 4 zile.Sferoizii au fost numărați după 14 zile.500 de celule transfectate cu plasmida de supraexpresie DARS-AS1 sau o plasmidă de control au fost utilizate pentru testul de îmbunătățire, altfel metoda a fost neschimbată.
ARN-ul a fost transcris utilizând ARN polimeraza T7 și biotin-16-UTP (Roche 1138908910) conform instrucțiunilor Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Primerii utilizați aici sunt enumerați în Tabelul suplimentar 4.
Regiunile PACT sau PKR care codifică proteine ​​au fost donate în pET15b (Addgene #73619) și transformate în BL21(DE3).Bacteriile au fost incubate peste noapte în LB furnizat cu ampicilină și apoi diluate de 100 de ori cu LB proaspăt.Când OD600 al mediului a atins 0,8, s-a adăugat 1 mM IPTG pentru a induce expresia proteinei.După incubare peste noapte cu agitare ușoară (250 rpm la 20°C), peletul celular a fost colectat prin centrifugare (4000 rpm, 10 min, 4°C).Resuspendați peleta celulară în tampon de liză (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) și incubați pe gheață timp de 30 de minute, apoi sonicate (15 min, 5 s pornit/oprit, pe gheață) și centrifugă (13.000 rpm)., 30 min, 4°С).Supernatantul a fost apoi încărcat pe rășină Ni-NTA (QIAGEN) de 3 ori la 4°C, spălat de 4 ori cu tampon de spălare (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidazol, 250 mM NaCI) și eluat de 3 ori, cu un total de de 10 ml tampon de eluent (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCI, 300 mM imidazol).Proteina purificată a fost determinată folosind WB și concentrația a fost determinată utilizând trusa de testare a proteinei Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Testele RIP au fost efectuate așa cum s-a descris anterior, cu modificări.Pe scurt, 1x tampon RIP (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40, inhibitor de ribonuclează RNasin (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protează) lizează cocktail citostatic 1 x 107 (Roche, 1 mM DTT) și centrifugă la 13.000 rpm timp de 15 minute la 4 ° C.Supernatantul a fost apoi incubat cu perle magnetice de proteină A+G (Millipore) conjugate cu 5 μg de anticorp anti-PACT (Abeam) sau IgG (CST).Granulele au fost spălate de 5 ori cu tampon RIP 5x, apoi digerate cu proteinază K (NEB).ARN-ul a fost extras cu Trizol și determinat prin RT-qPCR.Primerii sunt prezentați în Tabelul suplimentar 5.
Testul RIP in vitro a fost efectuat conform unui protocol de testare RIP standard modificat.Un total de 5 pmol de ARN transcris in vitro au fost diluați 1x cu tampon RIP și recoapți prin incubare la 65°C timp de 5 minute, urmată de răcire lentă la temperatura camerei.Un total de 5 pmol de proteine ​​PACT marcate cu flag intacte sau mutate au fost purificate din E. coli.Incubați cu ARN renaturat timp de 2 ore la 4°C și urmați procedura de mai sus pentru analiza RIP pentru IP anti-flag.
Pentru analiza extensiei ARN, 1x107 celule au fost lizate cu tampon 1xRIP.După centrifugare la 13.000 rpm timp de 15 minute la 4°C, supernatantul a fost pretratat cu 30 μl de perle magnetice de streptavidină (Beckman) timp de 2 ore la 4°C.Lizatul purificat a fost apoi furnizat cu ARNt de drojdie și incubat cu 40 pmol de ARN renaturat peste noapte la 4°C, apoi timp de încă 2 ore și s-au adăugat 20 μl de perle magnetice noi de streptavidină blocate cu BSA.Etapa de spălare a constat de 4 ori cu 5x tampon RIP și de 4 ori cu 1x tampon RIP.Proteinele corespunzătoare au fost eluate cu tampon de eluare cu biotină (25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 12,5 mM D-biotină, PMSF) și separate pe NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).După colorarea cu argint (Beyotime Biotechnology), anumite benzi au fost excizate și analizate de către MS.
Analiza Co-IP a fost efectuată pentru a testa interacțiunea dintre PACT și PKR.Pe scurt, lizatele supernatante au fost preparate prin incubarea a 1 x 107 celule lizate în 1 x tampon RIP urmată de centrifugare la 13.000 rpm timp de 15 minute la 4°C.Lizatele au fost încărcate cu perle magnetice de proteină A + G, conjugate cu 5 ug de anticorp anti-PACT și rotite ușor peste noapte la 4°C.Granulele au fost spălate de 3 ori cu tampon 5xRIP, de două ori cu tampon 1xRIP şi eluate cu tampon 1xSDS.Proteina recuperată a fost analizată cu gel SDS-PAGE și detectată de WB.
Doi pmol de PACT marcat și 1 pmol de PKR au fost purificați din E. coli.Se diluează în tampon RIP 1 x și se incubează cu 10 pmol de ARN renaturat timp de 2 ore la 4 °C.După aceea, au fost incubați cu anticorp anti-etichetat conjugat cu perle magnetice proteină A+G timp de încă două ore.Granulele au fost apoi spălate de patru ori cu 1x tampon RIP și eluate cu 1x tampon SDS.PACT și PKR rezultate au fost detectate de WB.